宠物食品中沙门菌的检测方法概述

孙玉祝，陈江楠，夏兆飞（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）



宠物食品中沙门菌的检测方法概述

孙玉祝，陈江楠，夏兆飞
（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

沙门菌是一种人畜共患病病原菌，如果污染宠物食品，将严重威胁到人类和伴侣动物的健康安全。宠物食品营养物质含量丰富，有利于沙门菌等有害微生物的生长繁殖。选择适当的检测方法，加强对宠物食品监督力度，可以一定程度上有效地降低沙门菌污染的风险，保障人类和伴侣动物的健康。

适用于检测宠物食品中沙门菌方法很多，可以概括分为传统微生物学、分子生物学以及免疫学等方法。但是，为了满足宠物食品快速检测的需要，逐渐引入试纸条、试剂盒以及自动化检测仪等快速检测方法。文章将主要就上述检测技术的原理和应用进行介绍，比较它们在宠物食品检测中的实用性以及优缺点，希望为宠物食品中沙门菌检测提供参考。

1　沙门菌污染及危害

沙门菌污染已经成为世界范围内宠物食品安全问题关注的重点。由美国食品和药品管理局（FDA）官方网站发布的信息获知，美国2014年的10起犬猫食品召回事件中，就有6起是因为怀疑污染或确认污染了沙门菌。新西兰学者T L Wong等[1]对新西兰本土生产及分别从澳大利亚、中国和泰国进口的宠物咬胶进行了检测，不同产地的产品中都检测出了沙门菌，检出率分别为6.7%、14%、4.1%和3.7%。国内目前暂时缺乏相关数据，但却有在鱼粉等饲料原料中检测出沙门菌的报道[2]。

沙门菌可以通过宠物食品感染伴侣动物和人，严重威胁人类的健康。动物和人感染沙门菌后，通常会表现出呕吐、腹泻或血痢以及发烧等严重症状，甚至会出现反复感染。2006年至2008年间，美国曾暴发人类感染沙门菌的事件，后经调查证实是由沙门菌污染了宠物食品而引起[3]。

2　沙门菌的检测方法

2.1传统微生物学方法传统微生物学方法是通过给予细菌生长繁殖所需的营养物质，适宜的温度和足够长的培养时间，使细菌分裂增殖到可检测数量，并利用细菌形态、菌落、生化以及血清学等特点进行鉴别的方法。宠物食品样品中可能含有大量肠杆菌科的细菌而沙门菌含量较少，或样本中沙门菌受损，直接选择性增菌容易产生假阴性，所以该方法检测沙门菌需要预增菌。该方法是沙门菌检测的一种标准方法，也适合用于其他检测方法检测效果的评价。但是从开始接种到最终鉴定操作复杂，费时费力，并不能很好地满足宠物食品样本批量快速检测的需要。

增菌和鉴定两个过程是该方法的主要限时步骤。对这两个步骤进行改进，可以明显缩短检测时间，增强传统方法的实用性。免疫磁珠或疏水网膜进行细菌富集可以有效缩短增菌所耗时间，但是如果样本中沙门菌数量非常少，则易出现假阴性结果。显色培养基、噬菌体以及电化学阻抗法等则是对鉴定步骤进行改进的方法。例如沙门菌在科玛嘉沙门菌显色培养基上会形成典型的紫色菌落。

2.2分子生物学方法分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）、基因芯片、核酸探针以及环介导等温扩增技术，其中PCR技术应用最广。

2.2.1聚合酶链式反应（PCR）PCR是一项在体外扩增靶基因片段的技术。选取目的菌基因序列中特异性和保守性较高的靶基因，利用PCR技术对靶基因进行扩增，可以实现对致病菌的检测。沙门菌的invA基因簇编码吸附和侵袭肠道上皮细胞表面侵袭蛋白，具有较高的属特异性，可以作为检测沙门菌的靶基因。根据国内外文献报道，invA基因编码的侵袭蛋白是沙门菌的主要毒力因子，以invA基因序列为靶基因设计引物[4]，并采用PCR技术检测宠物食品中的沙门菌，具有非常高的敏感性和特异性。此外，可应用于PCR检测的沙门菌属特异性基因还有：编码组氨酸转运操纵子hut基因、16S rRNA基因、编码鼠伤寒沙门菌肠毒素stn基因[5]及编码连四硫酸盐还原酶ttr基因[6]等。引物的特异性是PCR检测的特异性和是否成功的关键，引物特异性低常常会导致检测中的漏检和误检。因此，使用PCR技术检测宠物食品中沙门菌前，应对设计或引用的引物进行严格的验证。

传统PCR技术操作程序包括目的菌的浓集（增菌）、模板制备、PCR扩增以及产物检测。PCR扩增结果的判读需要借助凝胶电泳，但是电泳检测特异性却并不是很高。此外，传统PCR还具有步骤繁杂、易污染以及无法准确定量等问题。正是由于如上一些限制性因素，为了更好地实现PCR检测技术的快捷性和特异性，发展出了很多改进的PCR检测技术。这些技术不同程度上对传统PCR操作程序进行了优化。这些技术包括实时荧光定量PCR、Taqman PCR[4]、多重PCR、免疫捕获PCR以及免疫磁珠分离PCR等。例如，Balachandran，P等[7]利用实时荧光定量PCR技术实现对宠物食品中沙门菌的检测，检测结果与标准方法无显著差异，而且表现出了比标准PCR检测速度快、可量化以及自动化程度高等优点。

应用PCR技术检测宠物食品中得沙门菌还需要对样本进行预处理，排除PCR抑制剂。宠物食品残渣及与基质有关的抑制剂会干扰PCR检测灵敏度。国外文献报道[7]，通过低速离心、滤纸过滤、过滤捕获（例如，疏水网膜法），以及免疫磁珠捕获等方式对样本进行预处理，可以去除样本中的宠物食品残渣和基质，显著提高了沙门菌的PCR检测敏感性。

2.2.2环介导等温扩增（LAMP）LAMP是采用可以特异性识别目的基因的四条引物，在恒温条件下通过DNA聚合酶的催化作用对目的基因进行快速扩增。孙园园等[8]以沙门菌的fim Y蛋白基因序列为目的片段设计了4条特异性引物，并对各种条件进行优化，成功建立了针对动物饲料中沙门菌LAMP快速检测方法。并对24份样本重复3次检测，检测结果与饲料国标结果一致。该方法具有特异性强、比PCR检测敏感性高、检测速度快和不易受干扰等特点。此外，该方法还可以利用氧化硅为载体，实现对宠物食品中沙门菌等多种有害微生物的多重检测[9]。

2.3免疫学方法免疫学方法是在抗原抗体特异性反应的原理基础上建立起来的一系列检测方法，常用于沙门菌检测的方法包括酶联免疫吸附（ELISA）、免疫层析技术以及乳胶凝集反应，其中ELISA方法及其衍生方法应用最广。

ELISA是将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化活性的特点相结合而形成的一种固相酶联免疫分析技术。利用ELISA技术检测宠物食品中的沙门菌，主要是利用沙门菌抗原高特异性的单克隆或多克隆抗体。利用单克隆（或多克隆）抗体结合样品中的沙门菌抗原，再加入酶标抗体结合抗原抗体复合物，最终加入底物与酶发生反应，就可以将沙门菌抗原显色，实现对样本中沙门菌的检测。

早在20世纪70年代末，ELISA技术就被用于食品中沙门菌的检测，随着技术的不断改进，发展出很多传统ELISA的衍生技术，显著提高了对沙门菌等病原微生物的检测灵敏度和检测效率。这些衍生方法包括斑点酶联免疫（Dot-ELISA）技术、荧光酶联免疫分析技术、PCR-ELISA检测技术以及双夹心法ELISA等。Dot-ELISA技术[2]是采用硝酸纤维素（NC）膜代替传统的聚苯乙烯反应板，具有吸附力强、操作方便、检测快速等特点，可以同时检测多种抗原。但是正式应用前，需要进行标准化预试验确定适宜反应条件。荧光酶联免疫分析技术是在传统ELISA基础上发展而来，采用荧光底物代替传统生色底物，可借助仪器进行结果判读，提高了检测的灵敏度，避免人工判读误差[10]。

2.4快速检测试纸条和试剂盒常见可用于宠物食品中沙门菌的检测的试纸有β-萘酚辛酸酯试纸和API试纸。β-萘酚辛酸酯试纸[11]是依据沙门菌属可以产生特异性较强的辛酯酶解离辛酸酯类化合物的特性而设计的。采用该方法检测沙门菌具有快速、简单、直观和经济等特点，但是β-萘酚辛酸酯化合物不够稳定容易分解，保质期短，适合现制现用。API 20 E试纸是根据传统肠道杆菌生化及发酵反应设计而来，可用于宠物食品和饲料中沙门菌属的检测，具有检测快速及操作简便（标准化）等特点，是细菌鉴定的国际金标准。快速检测试剂盒主要是基于单抗酶联免疫技术、荧光PCR以及实时PCR等原理设计，可以实现短时间内批量产品的检测，极大地降低人力和时间成本投入。

2.5自动化检测仪器自动化检测仪器主要是基于微生物的生化代谢、免疫属性以及核酸特异性等特点而设计制造的。自动化检测仪器的出现减少人力和时间的投入，实现短时间内批量样品的检测，符合现如今宠物食品批量化生产检测的需要。现在常用的自动化检测仪器主要有全自动微生物分析仪和生物传感器。自动化微生物分析仪还表现出省时、方便操作、可标准化、可追踪性以及准确度高等特点。

2.5.1全自动微生物分析仪全自动分析仪因设计原理不同可以分为以下几类：（1）基于微生物生化反应原理设计，例如VITEK微生物鉴定仪和TEMPO全自动微生物定量分析仪。于晓婕等[11]采用TEMPO分析仪对烘干鸡肉（宠物食品）微生物污染情况进行检测，并与传统标准方法进行比较，两者符合度程度在97%以上；（2）基于酶联免疫技术，例如全自动荧光酶联免疫检测系统（VIDAS），黄嫦娇等[10]采用VIDAS系统对食品中沙门菌进行检测，并与传统标准方法进行比较，体现出检测快速、特异性以及敏感性高等特点；（3）以微生物特异的基因组为基础设计，例如全自动微生物基因指纹分析仪。与传统方法相比，利用全自动微生物分析仪检测宠物食品中沙门菌具有很多如上所述的优势，但是不可避免的一个问题就是高昂的仪器成本，这将会成为阻碍自动化仪器在中小型宠物食品制造企业普及的主要障碍。

2.5.2生物传感器生物传感器通常是由生物受体（bioreceptors）和变频系统（transducing system）两部分构成。生物受体是生物分子识别原件，可以与待检物质（如沙门菌）发生生物化学反应，变频系统也可以称作信号转换系统，可以将生物受体与待检物质的反应信号转换成可进一步处理的电信号或光学信号。通常可以分为抗体或抗原、酶、核酸（DNA）、细胞或细胞结构以及噬菌体五大类。实际应用的生物传感器中以酶、抗体和核酸三类生物受体为主。例如，Yang Song等[12]建立以切口酶（一种限制性内切酶）为辅助的生物传感器，E Delibato等[6]建立以沙门菌的单克隆抗体和多克隆抗体作为生物受体的免疫传感器；Xiaoyuan Ma等[13]建立以适体（与靶分子特异性结合的寡核苷酸序列）为生物受体的电化学生物传感器。这几种传感器都实现对宠物食品中沙门菌的检测，表现出较高的敏感性和特异性，并具有检测快速和操作简便等优点。此外，也有学者将电化学阻抗技术引入生物传感器中，检测结果也表现出了较高的敏感性。

3　结语与展望

虽然仅仅依靠检测手段并不会从根本上降低宠物食品中的沙门菌等微生物含量，但却能辅助生产者实现对宠物食品原料供应、生产、存储以及运输等环节的科学管理和监控，从根本上降低宠物食品中沙门菌等有害微生物污染的风险。传统微生物学方法是检测沙门菌的标准方法，然而检测耗时就成为该技术在实际应用中的“瓶颈”。鉴于此，分子生物学技术、免疫学技术、快速检测试剂（盒）以及自动化检测仪器等检测技术手段的引入，丰富宠物食品中沙门菌的检测方法，满足宠物食品工业批量准确快速检测的需要。随着技术的不断更新，我们相信会有越来越多的先进技术会被用于宠物食品中沙门菌的检测，宠物食品中沙门菌的检测技术也将更精确、简便和快捷，提升宠物食品安全，为伴侣动物和人类健康提供保障。

参考文献：

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[13] X Ma，Y Jiang，F Jia，et al . An aptamer-based electrochemical biosensor for the detection of Salmonella[J].J Microbiol Methods，2014，98C：94-98.

通讯作者：夏兆飞，E-mail：drxia@126.com

作者简介：孙玉祝（1988-），男，硕士，主要从事小动物营养学和内科学研究，E-mail：vetsunyuzhu@126.com

收稿日期：2014-12-17

中图分类号：S852.61+2

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0087- 03