恒温解旋扩增技术的改进和发展

刘宝山，张文奎，尹荣焕（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）



恒温解旋扩增技术的改进和发展

刘宝山，张文奎，尹荣焕
（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）

恒温解旋扩增技术（Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）是纽英伦生物实验室美籍华人KONG Hui-min于2004年发展建立的一种核酸等温扩增技术[1]，它模仿生物体内DNA的合成，在恒温条件下（62℃或37℃）凭借解旋酶解开双链DNA，然后引物与模板特异性结合，在DNA聚合酶的作用下合成互补链，进行特异性基因的扩增[2]。

与普通PCR技术相比，HDA不需要昂贵的PCR仪，扩增在同一温度下进行，无温度变化时间间隔，反应时间明显缩短，采用的聚合酶不易引起非特异性扩增，具有高度的敏感性，非常有利于在条件差的基层实验室推广应用，具有巨大的发展潜力和广阔的发展前景[3]。现在已有多种应用HAD进行疫病检测的报道[4-6]。

然而，HDA技术也有扩增片段较短、只扩增DNA等一些不足，但人们在这些方面对其又进行了一系列的改进和研究，使其性能更加优异，更符合临床检测的要求。

1　反应速度方面的改进

最初，HDA中经常使用的是大肠杆菌UvrD解旋酶，其解链速度为20 bp/s，连续性为100 bp左右[7-8]，解链能力较低，使得HDA扩增序列的长度只有70～120 bp左右。这远远不能满足人们基因扩增的要求，需要找到一种解链能力更强的解旋酶。2006年Yan Xu等发现了一种新的解旋酶（噬菌体T7基因4蛋白），其解链速度为300 bp/s，使得HDA扩增DNA的长度达到2.5 KB[9]，满足了常规基因扩增和检测的需要。

2008年Motre等通过使用一个卷曲螺旋连接头将TteUvrD螺旋酶（Thermoanaerobacter tengcongensis UvrD helicase）和Bstpol聚合酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I Large Fragment）连接起来，构建了一种融合酶helimerase，同时具有TteUvrD和Bstpol的活性；而且在恒温解旋扩增反应中比单独添加TteUvrD和Bstpol能合成更长的扩增片段[10]。

2　检测模板方面的改进

2006年Yan Xu等在HDA的基础上创建了一种可直接扩增完整环状质粒的环HDA法（The circular helicasede-pendent amplification，cHDA）[9]，让基因扩增和筛选同步完成，不但可以用在分子生物学实验中减少分析和构建质粒DNA的时间、提高产量，而且可以用于进行参与感染线形DNA的环状DNA的检测。而且，cHDA法的反应温度为25℃，在室温下就可进行，是一种实用的恒温基因扩增方法。

为能够扩增检测RNA，2007年Goldmeyer等建立了反转录恒温解旋扩增技术（isothermal reverse transcription-thermophilic helicase-dependent amplification，RT-tHDA），试验表明，其具有很高的敏感性和特异性。通过添加一种特殊的热稳定的单链结合蛋白建立的一步RT-tHDA反应体系，可以在不到10分种的时间内将埃博拉病毒（Ebola virus）的RNA扩增百万倍[11]。

2011年Doseeva等报道了一种多重HDA，可以同时进行沙眼衣原体和淋病奈瑟球菌的扩增，显示了很好的敏感性和特异性，并且可以对多种样品和培养基进行扩增，这种方法非常适合临床进行自动和高通量的检测[12]。

3　HDA与其他技术的联用

3.1HDA与酶联免疫吸附技术的联用2007年，Gill等将恒温解旋扩增技术和酶联免疫吸附技术联合起来，对幽门螺旋杆菌进行检测。通过设计针对ureC的引物，使用异羟洋地黄毒苷配基（DIG）标记的等温扩增程序对细菌的DNA进行了扩增。扩增产生的带有DIG标签的扩增产物热变性后同特异性的生物素标记的DNA探针杂交，DNA探针以非共价键的方式被固定在抗生物素蛋白链菌素包被的微量滴定板上。然后使用HRP标记的抗DIG抗体以及底物进行了比色测定。来源于胃组织的样本的测定结果同细菌培养相比分别具有90%和95.7%的敏感性和特异性。和其他的组织学研究相比分别具有96.6%和96.8%的敏感性和特异性[13]。2008年其又将纳米金探针和HDA相结合建立了检测幽门螺杆菌的方法，使用纳米金标记的探针和HDA产生的扩增产物杂交而形成的颜色使用比色法进行检测[14]。这种方法可以在1 h内最低检测到10 CFU/mL的幽门螺杆菌，同细菌培养相比分别具有92.5%和95.4%的敏感性和特异性。和其他的组织学研究相比分别具有100%和98.8%的敏感性和特异性。这两种方法操作都很容易，可以显著地节省幽门螺杆菌检测的时间和成本，在疾病的早期检测中具有很大的潜力。

3.2HDA与微阵列技术的联用为满足快速、特异、敏感地进行多项目检测的需要，2009年Andresen等发展了一种新的病原检测方法-解旋酶依赖性的芯片扩增技术（helicase dependent OnChip amplification，OnChip-HDA），其将恒温解旋扩增技术和微阵列进行结合，使基因分析和检测整合在一个反应中，在多病原检测中节省了时间和成本[15]。使用OnChip HDA方法对两种病原-淋球菌和金黄色葡萄球菌的检测证实了这些优点。其在反应装置上的简易性以及集约化和多病原分析中的潜力使其在小型实验室的芯片系统以及现场诊断中具有明显的优势。2012年Frech，G C等将HDA和芯片杂交技术相结合检测了鼻腔内金黄色葡萄球菌的携带情况，结果和细菌分离相比整体的相对敏感性为89%，特异性为94%[16]。

3.3HDA与核酸提取技术的联用2010年Mahalanabis报道了一种将核酸提取和HDA整合在一起的一次性检测装置[17]。在这个装置中，细菌裂解、核酸提取和核酸扩增整合在一起组成一个筒形的聚合体，使用一个活门和一个疏水的聚四氟乙烯薄纳米孔膜进行液体的控制，以荧光指示剂反映是否出现核酸扩增。这个装置可减少使用者的多次操行，并且可以最低检测到10个CFU的大肠杆菌。

3.4HDA与生物传感器技术的联用2011年Torres-Chavolla等还将DNA基的生物传感器和tHDA结合起来用来检测结核分枝杆菌，借助于便携式的手提稳压器可应用于偏远的实验室[18]。

3.5HDA与电化学技术的联用2011年Kivlehan等还报道了使用电化学方法进行HDA扩增结果的实时检测，通过检测嵌入了氧化还原电极的指示DNA的电流下降反应来检测扩增结果。这种方法不但可以进行不足1h内的目标核酸的定量分析，而且可以进行在扩增反应的终点进行DNA融解曲线的分析来区分特异性和非特异性扩增。这种检测方法非常适合发展为一种简单、确切、低廉并且高通量的检测装置，以取代更加复杂和昂贵的基于荧光的检测方法[19]。

3.6HDA与蛋白质技术的联用2013年Cao，A等使用一个带有转录因子结合位点的发夹探针将蛋白信号转换成DNA信号，借助核酸外切酶将多余的探针消化后进行HDA，实现了转录因子的零背景信号扩增。该方法具有良好的特异性和灵敏度，能最低检测到9.3×10-13M的转录因子，超过常用的检测方法4个数量级[20]。

综上所述可以看出，HDA作为一种新的恒温基因扩增方法，具有自身独特的优点，通过与相关技术整合联用，可以实现多种研究应用中的基因扩增，相信在不久的将来其必将得到广泛的应用和发展。

参考文献：

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作者简介：刘宝山（1975-），男，讲师，博士，从事动物疫病的诊断和防治，E-mail：18698890218@163.com

收稿日期：2014-11-26

中图分类号：S854.43

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0075- 02