流式细胞术检测登革热患者T淋巴细胞研究

石亚玲，赵　蓉，陈伟烈

(广州市第八人民医院：1.检验科；2.研究所，广东广州 510060)



流式细胞术检测登革热患者T淋巴细胞研究

石亚玲1，赵蓉1，陈伟烈2

(广州市第八人民医院：1.检验科；2.研究所，广东广州 510060)

摘要:目的探讨登革热患者的免疫状况。方法流式细胞术检测登革热患者的T淋巴细胞，从而分析患者的免疫状况。结果与健康者的参考范围进行比较，发现登革热患者的T淋巴细胞比例相对于健康者显著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴细胞百分比分别为(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴细胞数为(49.98±240.2)cells/μL，差异有统计学意义(P<0.05)、CD3+CD8+细胞数为(380.9±364.6)cells/μL，差异有统计学意义(P<0.05)，CD3+细胞数(874.8±541.2)cells/μL，差异有统计学意义(P<0.05)。结论登革热患者免疫状况异常，T淋巴细胞比例相对于健康者显著降低。

关键词:流式细胞术；登革热；免疫状况

登革热是由登革病毒引起，经伊蚊传播的一种急性传染病，潜伏期通常约5～7 d，具有传播迅猛、发病率高等特点。登革热患者有可能出现极度疲倦及抑郁症状，少数患者会恶化至登革出血热，并进一步发生出血、休克，乃至死亡，登革热引起的并发症往往是患者致死的主因。一般来说登革热主要分布在热带及亚热带地区。每年世界上有1亿人受到登革病毒感染，近年来，随着旅游业的发展和全球温暖化，登革热疫情日益严重，已经成为一个世界性的严重公共卫生问题[1]。郭汝宁等[2]报道2005～2010年广东每年都有发生登革热病例现象。

登革热发病机制至今尚未完全清楚，相关假说有:病毒亲嗜性、病毒毒力学说、宿主的易感因素、抗体依赖性增强感染作用(ADE)、交叉反应性T细胞反应及细胞因子风暴等假说。登革病毒通过伊蚊叮咬进入人体，在单核-巨噬细胞系统和淋巴组织中复制至一定数量后，即进入血循环(第1次病毒血症)，然后再定位于单核吞噬系统和淋巴组织之中[3]。

交叉反应性T细胞的激活假说是促进登革病毒感染临床进程的关键，与DHF/DSS发生有关。CD8+T细胞可以在DENV感染早期控制病毒感染，但是，在清除感染细胞的同时CD8+T也参与了DENV感染的病理过程。病毒可以诱导出不同的交叉反应性T细胞反应，这些低亲和力非中和性的细胞无法有效地清除病毒。在初次感染登革病毒的小鼠中，只产生少量的登革特异性CD4+T细胞；然而，4个血清型的登革病毒二次感染后将导致CD4+T 细胞的反应明显增加，不但提高了CD4+T细胞的INF-γ分泌水平，也增加了CD8+T 细胞的活化[3-4]。

本实验通过流式细胞术对登革热患者的T淋巴细胞进行检测，分析患者是否出现T细胞免疫异常。

1资料与方法

1.1一般资料收集本院确诊登革热患者1 112例，平均年龄(48.5±10.88)岁，无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史，50例健康者作为对照组。登革热患者的主要临床症状：发热、食欲下降、恶心、呕吐；皮疹持续3～4 d，一般与发热同时消退；不同部位、不同程度的出血，如消化道出血，血尿及阴道出血等；淋巴结肿大。

1.2仪器与试剂仪器为BD CantoII，试剂为CD3、FITC/CD8、PE/CD45、PERCP/CD4、APC、溶血素、绝对计数管，均购自BD公司。

1.3方法抗体与外周血加入绝对计数管中孵育15 min，加入500 μL 1×溶血素，避光孵育10 min，震荡混匀，上机检测。1.4统计学处理使用SPSS13.0统计软件进行统计分析，若方差不齐，则组间比较采用秩和检验。使用GraphPad Prism5软件进行作图分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

流式细胞术检测出各细胞绝对计数值，与健康者进行比较，发现登革热患者的T淋巴细胞比例相对于健康者显著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴细胞百分比分别为(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴细胞数为(49.98±240.2)cells/nL，差异有统计学(P<0.05)、CD3+CD8+细胞数为(380.9±364.6)cells/nL，差异有统计学意义(P<0.05)，CD3+细胞数(874.8±541.2)cells/nL，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

1 112例登革热患者中，总体趋势相对健康者是降低，但是也有患者在正常范围之内，也有患者是呈升高趋势:其中CD3+低于正常值的人数占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人数占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人数占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人数占6%，高于正常值的占16%。

表1　　登革热患者与健康者T细胞统计

*：P<0.05，与对照组比较。

图1　　登革热患者与健康者T细胞比较

3讨论

对于登革病毒，目前并没有特异的疫苗与病原治疗药物，主要采取对症治疗措施，医生尽可能做到早发现、早隔离、早治疗[5-6]。登革出血热，有休克、出血等严重症状，需积极处理。休克者应及时补充血容量，可选用右旋糖酐40(低分子右旋糖酐)、平衡盐液、葡萄糖盐水等。目前很多种具有应用前景的登革热疫苗和抗病毒药物正在开发,进入临床试验阶段，但是仍存在许多亟待解决的问题[7]。

登革热发病机制至今仍未完全阐明，其症状的严重程度受多种因素的影响。初次感染登革病毒,临床上表现为典型登革热,不发生出血和休克。再次感染异型登革病毒时,病毒在血液中与原有的抗体结合,形成免疫复合物,激活补体,引起组织免疫病理损伤,临床上呈现出血和休克。涉及参与的免疫反应包括体液免疫、细胞免疫、Fc受体介导的细胞凋亡等多个机制,彼此相互交错、促进和制约,推动疾病的进程[8]。

宿主的易感性影响到宿主对登革病毒感染的免疫应答，而免疫应答产生的细胞因子和交叉反应性T细胞在清除病毒的同时又可以引起组织和细胞损伤，加之病毒血清型毒力不同，产生的二次感染诱导ADE，使病理过程更加严重。最近有研究同样表明，登革病毒感染后首要靶细胞是单核细胞，而不是T 细胞或B 细胞[3,9-10]。

本研究中，流式细胞术检测出各细胞绝对计数值，与健康者进行比较，发现登革热患者的T淋巴细胞比例相对于健康者显著降低。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+与健康者相比显著降低。在1 112例登革热患者中，总体趋势相对健康者是降低，但是也有患者在正常范围之内，也有患者是呈升高趋势:其中CD3+低于正常值的人数占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人数占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人数占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人数占6%，高于正常值的占16%。大多数研究机制都说明T细胞会降低[11]，本研究中发现有一部分登革热患者T细胞升高，不管是升高还是降低，说明其免疫机制是紊乱的，具体的免疫机制需要进一步的研究。

参考文献

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[3]黄俊琪.登革热发病机制的研究进展[J].实用医学杂志,2011,27(19):3464-3465.

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[11]Godoy-Ramirez K,Franck K,Mahdavifar S,et al.Optimum cul ture conditions for specific and nonspecific activation of whole blood and PBMC for intracellul ar cytokine assessment by flow cytometry[J].J Immunol Methods,2004,292(12):1-15.

·论著·

Study on flow cytometry for detecting T lymphocytes in patients with dengue fever*

ShiYaling1,ZhaoRong1,ChenWeilie2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.ResearchInstitute,GuangzhouMunicipalEighth

People′sHospital,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Abstract:ObjectiveTo investigarte the immune status in the patients with dengue fever.MethodsThe flow cytometry was used to detect the T lymphocytes in the patients with dengue fever for analyzing their immune status.ResultsCompared with the reference range in the healthy individuals,it was found that the T lymphocyte proportion in the patients with dengue fever was significantly reduced compared with the healthy individuals.The percentages of CD3+CD4+and CD3+CD8+lymphocytes were (36.54±9.78)% and (17.7±10.01)% respectively,which had statistical difference compared with the control group(P<0.05),CD3+CD4+lymphocyte count was (49.98±240.2)cells/μL,the difference was statistically significant (P<0.05),CD3+CD8+lymphocytes count was (380.9±364.6)cells/μL,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe immune status in the patients with dengue fever is abnormal,T lymphocyte percentage is significantly reduced compared with the healthy individuals.

Key words:flow cytometry；dengue fever；immune status

作者简介：潘秋荣，男，副主任检验师，主要从事临床免疫学检验研究。

收稿日期：(2015-05-12)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.013A

文章编号：1673-4130(2015)24-3541-02