应用EP7-A2文件探讨溶血对重氮法测定总胆红素的干扰情况*

基金项目:浙江省医药卫生科技计划资助项目(2015YB262)。



应用EP7-A2文件探讨溶血对重氮法测定总胆红素的干扰情况*

*基金项目:浙江省医药卫生科技计划资助项目(2015YB262)。

管华玲1，吴健1，王源2，张汉东3△

(1.盐城市第一人民医院检验科，江苏盐城 224005；2.浙江省中医院检验科,浙江杭州 310006；

3.盐城市第三人民医院检验科,江苏盐城 224001)

摘要:目的应用EP7-A2文件评价溶血对临床总胆红素测定的干扰。方法依据EP7-A2文件要求的“配对-差异”实验对干扰物进行确认，并使用“剂量-效应”实验来分析干扰物浓度与干扰程度之间的关系。结果“配对-差异”实验结果显示5 g/L血红蛋白对A、B两种总胆红素试剂均有负干扰，但A试剂盒明显受溶血干扰程度小；“剂量-效应”实验结果显示血红蛋白对总胆红素检测A试剂盒可产生线性负干扰，低值标本的线性方程为Y=-0.146X+14.1，r=0.964，中值标本的线性方程为Y=-0.546X+92.24，r=0.947，高值标本的线性方程为Y=-1.153X+307.2，r=0.979。结论溶血对临床总胆红素测定的有线性负干扰，可以利用标本的血红蛋白浓度对总胆红素的值进行校正；EP7-A2文件在分析干扰评价方面具有一定的应用价值。

关键词:总胆红素；重氮法；EP7-A2文件；干扰实验

人体内的胆红素大部分来自衰老红细胞裂解释放出的血红蛋白代谢，其对神经系统功能具有严重的影响和干扰作用。肝脏是人体重要的代谢器官，对包括胆红素在内的代谢产物具有强大的处理能力。因此，在临床中，血清中胆红素浓度的高低是诊断肝病的重要指标。目前，全自动生化分析仪在绝大多数医院得到了使用，其检测胆红素的主要方法是重氮试剂法，通过仪器自动比色测定，因此，血标本的溶血、脂浊、黄疸等情况对检测结果具有很大的影响[1]。本研究拟依据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)制定的评价方案EP7-A2文件[2-3]，分析和评价溶血对重氮法试剂测定血清总胆红素的干扰情况。

1材料与方法

1.1材料溶血干扰物(血红蛋白储存液)的制备严格按照EP7-A2标准程序，采集5 mL肝素抗凝血；离心10 min制备压积红细胞；弃掉血浆，加入10 mL等渗盐水；轻轻颠倒试管10次，离心10 min，弃掉盐水洗涤液，重复用等渗盐水洗涤2次；用等体积的蒸馏水稀释细胞，颠倒试管10次充分混匀，冰冻过夜；解冻细胞，使其恢复至室温；离心30 min，除去细胞基质，保留上清液(血红蛋白溶血液)，除掉红细胞碎片；测定溶血液的血红蛋白浓度为125 g/L。

1.2仪器与试剂(1)仪器。检测采用雅培公司生产的Architect ci8200全自动生化免疫分析仪，其生化部分的胆红素检测方法为重氮试剂法，通过仪器自动比色测定。(2)试剂。总胆红素测定(重氮盐法)试剂盒(A试剂批号为41174UQ04；B试剂批号为93035HW00)，校准品为雅培公司提供的生化多项校准品，室内质控品为美国Bio-Rad公司生产的液体多项质控(水平2、3)。

1.3方法

1.3.1总胆红素测定的主要参数A、B试剂盒测定的方法均为一点终点法，测光点分别为20～22和31～33，主/副波长均为548 nm/604 nm。两个试剂盒使用的标本、R1试剂量、R2试剂量分别为，A试剂盒：2.6、160、40 μL，B试剂盒：5、160、40 μL。

1.3.2基础标本的制备选取无溶血、无黄疸、无脂浊的本院健康体检者的新鲜混合血清作为低值标本；采用无溶血、无脂浊的胆红素中度升高的患者混合血清作为中值标本；采用无溶血、无脂浊的胆红素重度升高患者混合血清为高值标本。

1.3.3对照标本和干扰标本的制备溶血干扰标本为1 920 μL 基础标本加入80 μL血红蛋白储存液，其血红蛋白浓度为5 g/L；对照标本为1 920 μL基础标本加入80 μL生理盐水。

1.3.4“剂量-效应”标本的配制及分析依据EP7-A2文件的要求，制备5个浓度的干扰测试标本，来确定1个线性的剂量效应关系。0浓度标本和1浓度标本按1.3.3要求制备的对照标本和干扰标本，并以此为基础按不同比例配成5种测试混合液，见表1。在同一分析批之内检测5种测试混合液，第1组按照升序测定各标本，第2组按降序测定，第3组按照升序，以降低系统漂移对检测的影响。

表1　　“剂量-效应”标本的配制

2结果

2.1溶血对总胆红素的干扰对测得的干扰标本和对照标本的结果进行数据分析，并根据1.2.6中的公式进行干扰判断，可见血红蛋白浓度为5 g/L时，溶血对A、B试剂盒的检测均有负性干扰，但A试剂盒抗干扰能力明显优于B试剂盒。见表2。

表2　　干扰标本和对照标本的测定结果与干扰判断

2.2溶血对总胆红素检测干扰的“剂量-效应”分析对A试剂盒进行剂量效应分析，不同浓度的血红蛋白对总胆红素测定产生的负干扰呈线性，低值标本的线性方程为Y=-0.146X+14.1，r=0.964；中值标本的线性方程为Y=-0.546X+92.24，r=0.947；高值标本的线性方程为Y=-1.153X+307.2，r=0.979。干扰效应结果见表3，“剂量-效应”回归分析图分别见图1～3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

表3　　溶血对总胆红素检测的干扰剂量效应结果

3讨论

在临床工作中，血清总胆红素测定是了解人体肝脏功能的重要指标之一，特别是当胆红素浓度显著升高时，常常反映人体肝脏有严重的细胞损伤；另外，在区分新生儿生理性、病理性黄疸时，血清总胆红素亦是主要指标之一。有研究者认为，在使用重氮法检测胆红素时，标本轻度溶血对检测结果没有明显的干扰，但当标本严重溶血时可使测定值低于实际值，其原因可能是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定[5-6]。溶血是常见的影响检测结果的分析前原因，新生儿采血比较困难，更易导致标本溶血，因此评价血红蛋白对总胆红素的分析干扰是有重要临床意义的。EP7-A2文件是干扰评价的标准方法，该文件对临床实验室中各种检测方法、仪器以及各种类型标本都有较好的适用，可用于分析临床多种可疑干扰物。依据EP7-A2文件，可先利用“配对-差异”方法来确认疑似干扰物是否对该检测项目的测定产生干扰，如果发现有干扰，则可以利用“剂量-效应”方法进一步评价干扰物浓度与干扰程度之间的相互关系[7-8]。

定了高、中、低值3个组。本实验应用EP7-A2文件建议的血红蛋白储存液对A、B两种总胆红素检测试剂盒在3个胆红素浓度水平进行可“配对-差异”分析，可知血红蛋白液对两种试剂均具有负干扰，但由实验数据可知A明显较B试剂盒受溶血干扰程度小，更具临床应用价值。本实验对总胆红素检测A试剂盒进行了“剂量-效应”分析，可知在低、中、高3个胆红素浓度，总胆红素的测定值与血红蛋白浓度间具有良好的相关性，因此，对于一些严重溶血的标本，总胆红素的检测值应为假性降低，可以本实验得出的线性方程，计算出总胆红素的真实值。

当然，EP7-A2文件也有其自身的局限性。在临床工作中，干扰常常来自于多种干扰物，而目前仍没有一种有效的试验方法可以同时鉴别所有的干扰物[9]。另外，一方面溶血的干扰可以降低总胆红素检测的数值，另一方面当严重溶血产生的未结合胆红素可以导致标本中总胆红素浓度增高，而最终总胆红素的测定结果是否会偏高，有待进一步的研究。所以医务人员应充分了解造成溶血的原因，在采集、处理标本的过程中，尽量避免溶血，为临床提供准确的诊断依据。

另外，在临床生物化学分析中，可以根据EP7-A2文件，利用已经上市使用的试剂盒，应用医学统计软件，对其他检测项目进行干扰评价，这样可以给临床和患者提供更加可靠的检验结果。

参考文献

[1]许晓文．溶血对血清总胆红素测定方法的影响[J]．吉林师范大学学报：自然科学版，2004(2)：107-111.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.EP7-A Interference testing in clinical chemistry[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2002.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.EP7-A2 Interference Testing in Clinical Chem istry,Approved Guideline-Second Edition[R].Wayne,PA,USA:CLSI,2005.

[4]姚少羽，刘一鸣，喻雄文，等．应用EP7-A2文件评价脂浊对淀粉酶的干扰及其定量化[J]．中山大学学报：医学科学版，2008，29(4S)：109-111.

[5]朱忠勇．实用医学检验学[M].北京：人民军医出版社，1997．408-415．

[6]安崇文，曹晨影，焦莉莉，等．4种总胆红素检测系统的性能评价[J]．临床检验杂志，2014，32(3)：230-235.

[7]Bossuyt x,Blanckaert N.Evaluation of interference in rate and fixed-time nephelometic assays of specific serum proteins[J].Clin Chem.,1999,45(1):62-67.

[8]孙虹，牛华，赵崇吉，等.胆红素、血红蛋白和乳糜微粒对生化检测结果的干扰评价[J]．国际检验医学杂志，2011,32(21)：2509-2512.

[9]徐建华，何敏，柯培锋，等．CLSI EP7-A2文件在临床化学分析干扰试验中的应用评价[J]．检验医学，2010，25(12)：971-974.

·论著·

Application of EP7-A2 document for investigating interference of hemolysis on total

bilirubin detection by diazonium method*

GuanLinghua1,WuJian1,WangYuan2,ZhangHandong3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YanchengMunicipalFirstPeople′sHospital,Yancheng,

Jiangsu224005,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangsuProvincialHospitalofChinese

Medicine,Hangzhou,Jiangsu310006,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,Yancheng

MunicipalThirdPeople′sHospital,Yancheng,Jiangsu224001,China)

Abstract:ObjectiveTo apply EP7-A2 document for evaluating the interference of hemolysis the total bilirubin detection in clinic.MethodsThe interferent was affirmed according to the "paired-difference" test required by the EP7-A2 document.The relation between interferent concentration and interference degree was analyzed by using the "dose-effect" test.ResultsThe "paired-difference" test results showed that 5.00 g/L hemoglobin had negative interference effect on two kinds of total bilirubin reagents.But the reagent kit A had little interference degree of hemolysis;The dose-effect test results showed that hemoglobin produced the linear negative interference effect on the reagent kit A of total bilirubin detection.The linear equation of low value sample was Y=-0.146X+14.1,r=0.964,which of middle value sample was Y=-0.546X+92.24,r=0.947 and which of high value sample was Y=-1.153X+307.2,r=0.979.ConclusionHemolysis has a negative interference effect on total bilirubin detection in clinic.The total bilirubin value could be corrected by using the hemoglobin concentration of sample;the EP7-A2 document has certain application value in the aspect of analyzing interference and evaluation.

Key words:total bilirubin;diazonium method;EP7-A2 document;interference test

收稿日期：(2015-05-08)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.007A

文章编号：1673-4130(2015)24-3525-03

通讯作者△，E-mail：piaoxue1982717@sina.com。

作者简介：管华玲，女，副主任技师，主要从事临床检验基础的研究。