基金项目:江西省自然科学基金项目(20114BAB215031);江西省卫生厅科技计划项目(20141152)。
CRLF2实时定量PCR检测方法的建立及初步应用*
*基金项目:江西省自然科学基金项目(20114BAB215031);江西省卫生厅科技计划项目(20141152)。
付晶晶,李红△,易丽君,乐萍,黄慧
(江西省儿童医院中心实验室,江西南昌 330006)
摘要:目的建立人细胞因子受体样因子2(CRLF2)实时定量PCR检测方法。方法设计特异性引物扩增目的基因CRLF2及管家基因ABL,将纯化的PCR产物进行TA克隆,经菌落PCR筛选并测序鉴定后,提取重组质粒DNA,紫外分光光度计检测浓度换算成copies/mL浓度,稀释制备成质粒标准品,制作标准曲线观察灵敏度和线性范围,同时对质粒标准品的稳定性进行评估。初步应用该方法检测10例健康儿童和10例急性淋巴细胞白血病(ALL)初诊儿童的骨髓单个核细胞CRLF2水平。结果CRLF2 PCR产物具有单一特异的熔解曲线;标准品的线性检测范围为103~108copies/mL;质粒标准品反复冻融 3 次仍旧稳定;临床标本的 CRLF2 水平均在标准品线性检测范围。结论该实验室建立的 CRLF2 实时定量 PCR 检测方法具有良好的特异性、线性范围和稳定性,可应用于临床 ALL 儿童 CRLF2 基因的定量检测。
关键词:实时定量聚合酶链反应;急性淋巴细胞白血病;细胞因子受体样因子2;质粒标准品
尽管新化疗药物及联合化疗方案应用,使得儿童急性淋巴细胞白血病(ALL) 无事件生存率取得长足进步,但仍有 20% 患儿对化疗不敏感或因化疗过度导致复发或第二肿瘤发生。因此,寻找与预后相关的分子靶标进行分层治疗和疗效评估,将有益于进一步提高儿童 ALL 的治愈率[1]。对细胞因子受体样因子2(CRLF2)的临床研究发现,ALL 儿童骨髓单个核细胞(BMMC)中 CRLF2 高表达水平与预后不良相关[2]。因此,本实验组拟建立 CRLF2 的实时定量 PCR(RQ-PCR)检测方法,用于ALL儿童 CRLF2 基因检测,为诊断儿童ALL和个体化治疗提供理论依据。
1资料与方法
1.1一般资料健康对照组及ALL儿童的BMMC及临床信息由本院中心实验室标本库提供,儿童年龄1~15岁,中位数3.2岁,所有标本取材均获儿童监护人知情许可。
1.2引物设计根据Genbank中人的CRLF2和ABL基因序列,选择保守区用Primer Premier 5.0设计引物,经Blast验证后交由上海英骏公司合成。目的基因CRLF2 上游引物:5′-GTT CAG TAC CGG AGC CCC TTC-3′,下游引物:5′-GTT TGG GAG GCG TTG GTG TC-3′,预计扩增长度为232 bp;内参基因ABL上游引物:5′-TCA TCA CCA CGC TCC ATT AT-3′,下游引物:5′-CAC CGT CAG GCT GTA TTT CT-3′,预计片段长度为178 bp 。
1.3仪器与试剂低温高速离心机(德国Eppendorf公司);-80 ℃超低温冰箱、Nanodrop2000(美国Thermo Fisher公司);荧光定量 PCR仪(美国ABI公司);凝胶成像分析系统(美国Bio rad公司)。Ficoll淋巴细胞分离液(北京索莱宝公司);逆转录试剂盒、Tag酶(美国Promega公司);Trizol、琼脂糖粉、Platinum®SYBR®Green qPCR Super Mix-UDG试剂盒(美国Invitrogen公司);胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司);pEASY-T1 Simple TA克隆试剂盒(北京全式金公司);E.coli DH5α感受态细胞为本室自制。基因测序由上海英骏公司完成。
1.4方法
1.4.1骨髓BMMC cDNA合成参照文献[3]和试剂说明书,提取健康对照组及ALL儿童BMMC总RNA后逆转录为cDNA,放置-20 ℃备用。
1.4.2质粒标准品的制备以健康对照组BMMC cDNA为模板,进行PCR扩增。内参ABL扩增条件为:94 ℃,5 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s 35个循环;72 ℃延伸10 min;CRLF2扩增条件为:94 ℃,5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s 35个循环;72 ℃延伸10 min。 PCR产物切胶回收纯化后进行 TA 克隆。将菌落PCR阳性的单克隆菌扩增提取质粒,送测序鉴定。构建成功的重组质粒测定浓度后用TE缓冲液10倍梯度稀释至102copies/mL,分装后放置-20 ℃备用。
1.4.3荧光定量PCR标准曲线的制作将梯度稀释的CRLF2和ABL标准品按照优化后的RQ-PCR条件进行定量检测,每个浓度设置3个复孔,并设置无模板对照(NTC)3管。PCR反应结束后,结合熔解曲线进行分析,观察产物特异性。记录标准曲线的斜率、截距以及相关系数,观察线性范围。
1.4.4质粒标准品稳定性试验将分装放置在-20 ℃保存的质粒反复冻融3次,选用107、105、103copies/mL即高、中、低三个浓度同一批次质粒进行组内试验,不同批次质粒进行组间试验,验证质粒的稳定性。
1.4.5临床标本检测检测10例健康对照儿童和10例ALL初诊儿童BMMC cDNA CRLF2 水平,每份标本同步测定内参基因ABL,测定3个复孔;ABL Ct值大于35视为标本不合格,数据弃用;每个基因设定3管NTC;选用107、105、103copies/mL作为阳性标准品,制作标准曲线。根据标准曲线自动得到标本CRLF2、ABL的绝对定量水平,再以 CRLF2/ABL 绝对表达量比值为该标本的CRLF2相对表达水平。
2结果
2.1PCR产物琼脂糖电泳以健康对照组BMMC cDNA为模板,定性PCR扩增管家基因ABL和目的基因CRLF2,扩增产物电泳观察到与预计大小相符的单一条带,见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。
2.2重组质粒测序鉴定筛选重组子质粒送往测序,将测序结果与Genbank 公布序列一致的重组质粒分别命名为pEASY-T1-Simple-ABL、pEASY-T1-Simple -CRLF2。测序结果见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。
2.3RQ-PCR方法学评价
2.3.1特异性分析从熔解曲线可见,管家基因和目的基因都仅出现产物单峰,ABL 熔解温度为89.0 ℃,CRLF2熔解温度为85.1 ℃,说明引物特异性强,无非特异性扩增。见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。
2.3.2线性范围结果显示,质粒标准品在103~108copies/mL浓度间具有良好相关性。ABL标准曲线斜率为-3.65,R=0.999 9;CRLF2标准曲线斜率为-3.64,R=0.999 2,见图4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。
2.3.3稳定性分析分析结果可见,标准品批内CV值均小于3.0%,批间CV值均小于4.0 %,NTC阴性,证实标准品及本方法的重复性良好,结果见表1。
表1 ABL/CRLF2标准品批内及批间重复性试验
-:无数据。
2.4临床标本检测应用本系统检测临床标本,所有标本均在标准品的线性范围,ALL组CRLF2相对表达水平显著高于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。
3讨论
CRLF2参与正常淋巴细胞的成熟与分化。2009年Russell等[4]首次报道CRLF2异常高表达可能是造成ALL发生的直接机制。I-Ming等[5]发现有17.5% ALL儿童存在由CRLF2基因异位、缺失、突变造成的失调性高表达,Harvey等[6-7]多中心临床研究报道CRLF2高表达在ALL高危组中为预后不良的独立危险因素,应予以高度重视。因此,作为一个潜在判断ALL预后的分子标志物,CRLF2定量检测已引起ALL临床应用研究的重视。本研究组将CRLF2纳入本院ALL分子诊断平台建设体系中,希望建立优良稳定的CRLF2基因定量检测方法,为临床ALL儿童的个体化治疗预后判断提供参考。
相对探针法而言,SYBR Green I染料法性价比高且操作简便,因而应用更为广泛,但由于SYBR Green I能与任何双链DNA结合,因此需要优化反应体系并结合熔解曲线分析以确保反应特异性[9]。本研究小组建立的CRLF2 RQ-PCR检测方法经一系列评估实验显示:本方法特异性强,线性范围广,荧光信号与扩增Ct值相关系数大于0.999,质粒标准品经反复冻融3次后,批内及批间变异系数均低于4%,证明该方法完全符合实验要求,可应用于临床CRLF2检测。笔者将该建立的方法初步应用于健康及ALL儿童的临床标本检测,所有样本的CRLF2 mRNA水平均在标准品线性范围内,因此本方法具有特异性强,可行性好的特点,完全符合检测要求。
综上所述,本研究成功建立了CRLF2基因RQ-PCR检测方法,为ALL儿童个体化诊疗和CRLF2转化医学研究提供了参考工具。
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·论著·
Establishment and preliminary application of real time PCR assay for quantitative detection of CRLF2*
FuJingjing,LiHong△,YiLijun,YuePing,HuangHui
(CentralLaboratory,JiangxiProvincialChildren′sHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)
Abstract:ObjectiveTo establish a real-time quantitative PCR method for the detection of cytokine receptor-like factor 2(CRLF2) expression.MethodsSpecific primers amplification target gene CRLF2 and housekeeping genes ABL were designed,the purified PCR products were performed the TA cloning.After bacterial colony PCR screening and sequencing,then the recombinant plasmids DNA was extracted and measured by using UV spectrophotometer and converted to copies/mL concentration.Finally it was diluted for preparing the plasmid standard substance,then the standard curve was drawn for observing the sensitivity and linear rang,meanwhile the stability of the plasmid DNA was evaluated.This method was initially applied to detect the CRLF2 level of bone marrow mononuclear cells in 10 cases of healthy children and 10 cases of newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia(ALL).ResultsCRLF2 PCR product had a single specific melting curve;the linear detection range of the standard substance was 103 - 108 copies / ml;the plasmid standard substance by freeze-thawing for 3 times remained stable;the CRLF2 level of clinical sample was within the linear detection range of standard substance.ConclusionThe real-time quantitative PCR method for CRLF2 established by our laboratory has good specificity,linearity range and stability,which can be applied to the quantitative detection of CRLF2 gene in clinical ALL children.
Key words:real-time quantitative polymerase chain reaction;cytokine receptor-like factor 2;acute lymphoblastic leukemia;plasmid standard substance
收稿日期:(2015-05-08)
文献标识码:
DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.005A
文章编号:1673-4130(2015)24-3520-03
通讯作者△,E-mail:icemade@hotmail.com。
作者简介:付晶晶,女,主管检验技师,主要从事儿童白血病分子诊断及耐药机制研究。