TIM3在肿瘤微环境中作用的研究进展①

陶景莲　李丽娟　邵宗鸿

(天津医科大学总医院，天津300052)



TIM3在肿瘤微环境中作用的研究进展①

陶景莲李丽娟邵宗鸿

(天津医科大学总医院，天津300052)

恶性肿瘤严重影响人类健康，目前肿瘤的治疗手段包括放疗、化疗及分子靶向性治疗[1]。细胞免疫系统对肿瘤细胞的杀伤过程包括：肿瘤细胞的识别、肿瘤抗原被呈递给T细胞、T细胞激活及特异性杀伤肿瘤细胞。在这个过程中，T细胞的激活需要协同刺激信号，而这些信号需要“免疫检查点”的调控[2]， “免疫检查点”分子研究较多的有：T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡因子-1(PD-1)及其配体(PD-L1)等，它们在肿瘤微环境的免疫调节中起重要作用，本文将对其在肿瘤微环境中的作用展开综述。

1TIM3及其信号转导通路

1.1TIM3分子生物学特性T细胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin and mucin-3，TIM3)在2002年[3]第一次被发现，TIM3是TIM家族成员，由301个氨基酸组成的Ⅰ型膜蛋白。TIM分子的共同结构包括：免疫球蛋白N末端可变区、黏蛋白结构域、跨膜区和胞内区。其胞外部分包括一个富含半胱氨酸的免疫球蛋白样区域和一个黏蛋白区域(黏蛋白区富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸)，在免疫球蛋白可变区由4个半胱氨酸组成的高度保守的不同于其他免疫球蛋白超家族成员的独特裂隙：它可以与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。TIM3选择性地表达在分泌IFN-γ的T辅助细胞(Th1和Th17)、T调控细胞(Treg)、树突状细胞(DCs)、单核细胞、肥大细胞、NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)上，在肿瘤细胞上亦有表达，如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤[4-6]。

1.2半乳凝素-9(Galectin-9)Galectin-9是TIM-3的配体，属于半乳凝素家族，Galectins即半乳糖苷结合蛋白，现有14种亚型，由大约130个高度保守的氨基酸序列组成糖识别结构域。Galectin-9由2个串联的糖识别结构域(CRD)通过一条肽链相连，相对分子质量为36 kD，具有β半乳糖结合活性。

Galectin-9具有调节生物学功能的多样性，如细胞的聚集与黏附、肿瘤细胞的凋亡等。当TIM3与其配体Galectin-9结合，可抑制Th1和Th17扩增，促进Th1凋亡、CD8+T细胞功能耗竭，诱导髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)的大量扩增，从而直接和/或间接地促进外周免疫耐受，抑制机体抗肿瘤免疫[7]。在肿瘤形成的早期，TIM3+CD4+T细胞分泌IFN-γ而具有抗肿瘤作用；而在肿瘤形成的中晚期，TIM3+Treg细胞增殖，从而阻碍癌巢中效应T细胞发挥功能[8]。

1.3高迁移率族蛋白B1(High-mobility group protein 1,HMGB1)在TIM3+DCs或TIM3-DCs，用重组Galectin-9或Galectin-9单克隆抗体处理，却不能抑制核酸介导的细胞因子的产生， 提示TIM3 调节Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)介导的固有免疫应答并不依赖 Galectin-9，而依赖HMGB1。肿瘤浸润性DC高表达TIM3与HMGB1特异性结合，减少肿瘤死亡细胞的核酸进入到DC细胞中，从而抑制核酸引起的抗肿瘤免疫反应[9]。

1.4TIM3信号转导通路关于TIM3诱导免疫耐受机制的研究，Huang等[10]发现T细胞表癌胚抗原细胞黏附分子1(Carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1， Ceacam-1)和TIM3存在共表达的特性， BAT-3是TIM3下游的一个抑制性分子，它可以与TIM3进行结合从而抑制TIM3的活性。在Ceacam-1刺激之后，TIM3转基因小鼠T细胞中TIM3与BAT3的相互作用减弱，提示在Ceacam-1的作用下TIM3得到了活化。在人工诱导的小鼠大肠癌模型中，Ceacam-1+TIM3+细胞比例远高于其他类群的CD4+T细胞，大肠癌对TIM3转基因小鼠的致死率是100%，远高于野生型小鼠及Ceacam-1-/-小鼠，共同阻断Ceacam-1和TIM3则可改善抗肿瘤免疫功能从而清除肿瘤细胞，提示Ceacam-1与TIM-3联合作用导致T细胞对肿瘤细胞产生免疫耐受。WU等[11]用TIM3去刺激黑色素瘤细胞后，肿瘤细胞上的IκB和NF-κB的表达均增加，而在给予TIM3抗体后其表达却抑制，表明内皮细胞上的TIM3可以通过活化NF-κB信号通路来促进黑色素瘤细胞的转移。

在自身免疫性疾病中,TIM3可以通过抑制巨噬细胞向M1极化，从而减轻调节炎症在肠病(IBD)模型鼠的炎症反应及淋巴细胞的浸润，而阻断TIM3则会造成肠道炎症反应加重。在TLR-4基因敲除IBD模型鼠中，阻断TIM3则不会出现肠道炎症反应的加重及巨噬细胞向M1极化的增加，这提示TLR-4参与了TIM3信号通路的转导[12]。

在慢性感染中，TIM3单抗阻断H.pylori感染和疫苗接种小鼠体内TIM3信号通路从而上调TLR4、MyD88的表达，并促进NF-κB活化，降低Treg的数量，上调Th1免疫反应，提示TIM3与TLR4信号通路呈负性调控关系[13,14]。然而在结核杆菌感染过程中，TIM3+T细胞却可产生更强的细胞因子，利于清除巨噬细胞内的结核杆菌，同时通过TIM3/Gal-9通路刺激巨噬细胞产生IL-1β，从而上调TNF 和TNFR1，激活caspase-3，限制结核菌在胞内的增殖[15,16]。

2TIM3在肿瘤微环境中的免疫抑制作用

2.1抑制Th1和Th17细胞TIM3特异性表达于活化的Th1细胞，受转录因子T-bet的调节[17]。Ge RT等[18]人阐述了TIM3诱导Th1细胞凋亡的主要机制：当Th0细胞极化为Th1细胞后高表达TIM3，将其与重组TIM4共培养便会在Th1细胞表面形成TIM3-TIM4复合体，该复合体促进Th1细胞p300磷酸化，上调FasL从而促进Th1细胞的凋亡。

将Th1和Th17细胞分别暴露在不同浓度的特异性抗原HEL(Hen egg lyzosome)中，发现Th1细胞对活化诱导的细胞死亡(Activated induced cell death，AICD)比Th17更敏感。检测Th1和Th17细胞的mRNA，发现Th1细胞中TIM3 mRNA转录高于Th17细胞[19]。

2.2诱导CD8+T细胞“耗竭”CD8+T细胞“耗竭”是指T细胞在受到抗原刺激后不能大量增殖并产生细胞毒性和细胞因子。事实上，TIM3、PD-1、LAG-3和Ceacam-1[9]等抑制性分子在CD8+T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)上共表达，尤其是TIM3和PD-1，应用TIM3和PD-1双通路阻断剂Runx1、IRF5和IRF7等基因开始上调[20]，可以明显遏制肿瘤生长，若仅阻断PD-1通路，其抗肿瘤效应降低[21,22]，可能由于TIM3单抗同时阻断了癌巢内TIM3+Treg细胞的归巢从而降低了Treg的免疫抑制功能[23]。黑色素瘤患者外周血中TIM3+CD8+T和TIM3-CD8+T细胞均较正常人分泌IFN-γ和TNF-α水平低[24]。TIM3阻断剂联合PD-1阻断剂可以增强黑色素瘤疫苗中肿瘤抗原特异性CD8+T的活性[25-27]。静脉注射MVA-MUC1(Modified Vaccinia virus Ankara viral vector expressing the human mucin 1 tumor-associated xeno-antigen)给肾癌小鼠，发现MVA-MUC1联合TLR9激动剂可以促进MUC1-CD8+T细胞增殖，下调TILs 的TIM3和PD-1，从而控制肿瘤的体积[28]。

在细胞免疫治疗临床实验中IL-12可诱导NK和T细胞产生IFN-γ，曾一度成为抗肿瘤的理想药物，后发现其临床反应不容乐观，主要由于IL-12诱导T细胞高表达TIM3引起T细胞耗竭从而限制了IL-12的应用[6]；嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)在急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤中取得良好疗效，Moon等[29]尝试将CAR-T注射入间皮瘤免疫缺陷小鼠体内观察其对实体肿瘤的疗效时发现肿瘤的体积虽然缩小，却不能完全清除肿瘤并治愈小鼠，且这些CAR-T细胞移到肿瘤微环境外其功能可逆，仍然是肿瘤微环境诱导这些T细胞表达 TIM3、PD-1、 LAG3、2B4等免疫抑制分子，限制了CAR-T在实体肿瘤中的应用。

2.3促进Treg成为高度免疫抑制的细胞群在肿瘤微环境中，TIM3+Treg细胞具有高度免疫抑制作用[19]，卵巢癌的患者肿瘤浸润性TIM3+Treg通过大量分泌IL-10从而抑制CD8+T细胞胞内IFN-γ水平，促进机体的肿瘤免疫耐受，应用TIM3阻断剂可以逆转CD8+T细胞的功能，同时应用IL-10阻断剂可以部分逆转CD8+T细胞的功能[30]。在体内共阻断TIM3和PD-1信号通路可以下调Treg的免疫抑制功能分子，如穿孔素等，降低Treg活性，上调IRFs(IFN的干扰素转录因子)；且TIM3+Treg在肿瘤组织内的积累先于CD8+T细胞的“枯竭”，在这个时间窗祛除Treg能够避免CD8+T细胞 “耗竭”[31]。然而，TIM3亦可以通过促进Treg细胞凋亡而重新建立免疫平衡状态，促进前炎症反应和抗肿瘤免疫功能[32]。

2.4促进MDSCs大量扩增TIM3还可以通过诱导MDSCs的增殖间接抑制免疫应答。 MDSCs是一群CD11b+Gr-1+异质性髓系来源的细胞，具有强大的T细胞免疫反应抑制功能，它们的出现与肿瘤的不良预后密切相关[33]。MDSCs分为两个亚群：单核细胞来源的Ly6G-Ly6Chigh细胞和粒细胞来源的Ly6G+Ly6Clow细胞。转基因过表达TIM3则抑制T细胞功能，同时出现形态学上符合粒细胞来源MDSCs细胞的CD11b+Ly6G+细胞增加[34]；剔除TIM3后，CD11b+Ly-6G+细胞恢复至正常水平，免疫反应恢复正常；过表达Gal-9同样会导致CD11b+Ly6G+细胞增殖和免疫抑制。提示TIM3/Gal-9信号通路可以通过调节MDSCs的增殖来调节免疫反应。在动物模型中，阻断TIM3同时激活CD137(由激活T细胞产生的系统共刺激分子，促进T细胞增殖)信号后，卵巢癌肿瘤微环境中Treg及MDSCs均减少，CD4+T和CD8+T细胞分泌IFN-γ增多[35]。

2.5TIM3与天然免疫细胞在肿瘤免疫中的作用天然免疫是肿瘤免疫的第一道防线，DCs通过HMGB1介导的内吞作用清除具有免疫源性的核酸等物质。无论在动物模型还是在肿瘤患者的DCs上均有TIM3过表达[9]，肿瘤患者TIM3高表达于DCs较肿瘤浸润性CD8+T细胞出现得更早，水平更高，而正常人TIM3在DCs上表达率极低。TIM3与核酸竞争性结合在HMGB1的同一个结构域，阻碍核酸与HMGB1形成复合物，核酸不与HMGB1形成复合物则无法被TLR(如TLR3、TLR7和TLR9配体、DNA和RNA的细胞质传感器)识别，白介素受体相关激酶(Interleukin receptor associated kinase,IRAK)通路被阻断，进而阻断IRF3和NF-κB，在体内外激活以及IFN-β1和IL-12的产生，导致固有免疫抑制和肿瘤免疫逃逸[36,37,38]。

在体内联合应用TIM3单克隆抗体与顺铂可显著减小肿瘤的体积，且TIM3+DCs的缺失可增强顺铂的抗肿瘤作用[9]。因此，TIM3阻断剂与免疫源性核酸或细胞毒性药物的联合应用有望提高抗肿瘤疗效。

2.6TIM3在肿瘤细胞上的表达及意义TIM3不仅表达于免疫细胞，在卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤等肿瘤细胞中也有过表达[38,40,41]，并直接促进肿瘤的增长。下调TIM3的表达可以明显抑制Hela细胞的侵袭和转移[42]。TIM3的过表达均与肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌的不良预后密切相关[42-45]。在血液系统肿瘤中，TIM3过表达于急性髓系白血病的白血病干细胞[46,47]、MDS患者的造血干细胞上，且TIM3+造血干细胞具有低分化、低凋亡及高增殖的恶性生物学特征[48]。

综上所述，TIM3作为重要的免疫调控因子，其免疫调节具有多样性：参与Th1和Th17细胞的凋亡，CD8+T细胞的耗竭，促进Treg细胞和MDSC大量扩增，阻碍DCs活化及分化，它的存在不利于机体的抗肿瘤免疫，阻断TIM3信号或联合处理其他协同刺激信号可有效抑制肿瘤生长。目前对TIM3的调控因素及其下游的信号通路仍需进一步鉴别。作为与PD-1、CTLA-4相似的分子，TIM-3有望成为免疫治疗肿瘤的靶点分子，提高肿瘤患者的生活质量。

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[收稿2015-11-30修回2016-01-04]

(编辑倪鹏)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.032

作者简介：陶景莲(1982年-)，女，博士，主治医生，主要从事血液内科学方面研究，E-mail：taojingliantt@163.com。 通讯作者及指导教师：邵宗鸿(1958年-)，男，教授，主要从事血液内科学方面研究，E-mail：shaozonghong@sina.com。

中图分类号R730.3

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-1070-04

①本文为国家自然科学基金资助项目(81570111)、国家自然科学青年基金资助项目(81500101)、天津市应用基础研究项目资助(15JCYBJC24300)和天津医科大学总医院青年孵育基金(ZYYFY2014026)。