EAE小鼠胸腺萎缩与疾病严重程度关系的初步探究①

魏高辉　郑配国　张俊华　马雪涵　孟宪春　明　亮　刘红春

(郑州大学第一附属医院检验科，河南省检验医学重点实验室，郑州450052)

[摘　要]　目的：研究EAE小鼠胸腺萎缩与疾病严重程度的关系。方法：MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠诱导EAE,分析EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩的关系，流式细胞分析胸腺CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞与疾病严重程度的关系。 结果：尾部无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(20.25±3.49)×106个，双后肢无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(4.93±0.85)×106个，双后肢瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(1.8±0.19)×106个，四肢完全瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(0.52±0.07)×106个，组间差异有统计学意义(P<0.05)；EAE疾病越重，CD4+CD8+双阳性细胞在胸腺细胞中的比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例越高，不同疾病组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩程度关系密切，EAE小鼠中活化T细胞的定向迁移可能导致胸腺萎缩。

[关键词]　实验性自身免疫性脑脊髓炎；胸腺；萎缩

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

EAE小鼠胸腺萎缩与疾病严重程度关系的初步探究①

魏高辉郑配国张俊华马雪涵孟宪春明亮②刘红春②

(郑州大学第一附属医院检验科，河南省检验医学重点实验室，郑州450052)

[摘要]目的：研究EAE小鼠胸腺萎缩与疾病严重程度的关系。方法：MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠诱导EAE,分析EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩的关系，流式细胞分析胸腺CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞与疾病严重程度的关系。 结果：尾部无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(20.25±3.49)×106个，双后肢无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(4.93±0.85)×106个，双后肢瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(1.8±0.19)×106个，四肢完全瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(0.52±0.07)×106个，组间差异有统计学意义(P<0.05)；EAE疾病越重，CD4+CD8+双阳性细胞在胸腺细胞中的比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例越高，不同疾病组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩程度关系密切，EAE小鼠中活化T细胞的定向迁移可能导致胸腺萎缩。

[关键词]实验性自身免疫性脑脊髓炎；胸腺；萎缩

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

中图分类号①本文为国家自然科学基金项目(81172835)。

通讯作者②，E-mail:xingyunerliu@163.com；E-mail:jykmingliang@163.com。

作者简介：魏高辉(1989年-)，男，主要从事自身免疫病机制方面的研究，E-mail:wghyxjy@163.com。

[Abstract]Objective:To study the relationship between atrophy of the thymus and disease severity in EAE.Methods: MOG35-55 peptide induced EAE in C57BL/6 mice and analyzed the relationship between the severity of EAE and thymic atrophy，Flow cytometry analysis was used to evaluate thymic CD4+CD8+DP cells,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cells in relation to the severity of the disease.Results: The number of thymocytes in mice with decreased tail tone was (20.25 ± 3.49)×106,hindlimb weakness(4.93 ± 0.85)×106,complete hindlimb paralysis(1.8 ± 0.19)×106,and forelimb and hindlimb paralysis(0.52 ± 0.07)×106，there were statistically significant differences between groups(P<0.05).As the disease progresses,CD4+CD8+DP cells ratio decreased,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cell ratio increased,different disease groups was statistically significant difference (P<0.05).Conclusion: The atrophy of thymus was closely related to the severity of EAE.Migration of activated T cells in EAE may cause atrophy of thymus.

Preliminary inquiry EAE mouse atrophy of thymus relationship with disease severity

WEIGao-Hui,ZHENGPei-Guo,ZHANGJun-Hua,MAXue-Han,MENGXian-Chun,MINGLiang,LIUHong-Chun.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,HenanKeyLaboratoryofMedicalLaboratory,Zhengzhou450052,China

[Key words]Experimental autoimmune encephalomyelitis;Thymus;Atrophy

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是自身免疫相关的中枢神经系统脱髓鞘疾病，自身髓鞘抗原特异性CD4+T细胞与疾病密切相关[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS的理想动物模型，与MS具有类似的病理特征。Tsunoda等[2]研究发现，EAE小鼠可出现胸腺、脾脏、淋巴结的严重萎缩及大量胸腺淋巴细胞凋亡。胸腺作为中枢免疫器官，是T细胞分化发育的主要场所。前期研究发现，EAE小鼠发病高峰期胸腺严重萎缩，CD4+CD8+DP细胞减少。为探究EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩的关系，本研究计数不同疾病严重程度EAE小鼠胸腺淋巴细胞，分析T细胞亚群比例变化，探讨胸腺淋巴细胞变化与疾病的关系，以期阐明胸腺萎缩机制。

1材料与方法

1.1材料C57BL/6小鼠6~8周龄在河南省实验动物中心SPF级环境中饲养。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG35-55)由上海吉尔生化公司提供；百日咳毒素 (Pertussis toxin,PT ) 由北京联立信生物技术有限责任公司提供；大鼠抗小鼠抗体(CD4-FITC,CD8-PE)由eBioscience公司提供。

1.2免疫小鼠实验C57BL/6小鼠49只，随机抽取45只小鼠诱导EAE，另外4只作为对照。诱导EAE：CFA(含5 mg/ml的灭活的结核杆菌素)与1.5 mg/ml的MOG溶液等体积混合后彻底乳化，于小鼠双侧背部皮下免疫(200 μl/只)，在免疫后当时和第二天尾静脉注射PT稀释液(200 μl/只)。对照组小鼠在双侧背部皮下注射PBS(200 μl/只)，在当天和第二天尾静脉注射PBS(200 μl/只)。小鼠每天进行临床评分：0分无临床症状；0.5分尾部无力 ； 1.0分尾部瘫痪 ；1.5分一后肢无力 ； 2.0分两后肢均无力 ；2.5分一后肢瘫痪另一后肢无力 ；3.0分双后肢瘫痪 ；3.5分后肢瘫痪及前肢无力 ； 4.0分四肢全部瘫痪 ；5.0分死亡 。

1.3小鼠处理我们诱导的EAE小鼠发病特点是进展期进展迅速。小鼠处死时间以小鼠发病阶段处于发病高峰期为准，我们确定EAE小鼠发病高峰期以临床评分稳定不变3 d，在第3天处死小鼠，即发病高峰期小鼠。由于小鼠个体差异，发病时间及进展至高峰期时间不同，处死小鼠的时间依据上面的标准。EAE小鼠发病高峰期疾病严重程度各有不同，分组依据以发病高峰期小鼠临床评分为准，在后期统计中对所有EAE小鼠进行分析。另外，为验证缓解期变化，有一部分发病较重小鼠(临床评分3.5以上)，分成EAE高峰期小鼠组和EAE缓解期小鼠组，EAE高峰期小鼠组在高峰期处死，EAE缓解期小鼠组继续记录观察小鼠临床评分，在EAE小鼠进入缓解期临床评分稳定不变第3天处死，取胸腺。

1.4制备脊髓组织切片EAE小鼠在发病高峰期，在深度麻醉下，用40 g/L的多聚甲醛溶液进行心脏灌注，然后取出脊髓，放入40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，切片进行HE染色观察淋巴细胞浸润和脱髓鞘现象。

1.5胸腺淋巴细胞分离计数及流式细胞术分析实验组小鼠诱导EAE后，发病高峰期(依据见材料与方法1.3)记录小鼠临床评分；EAE缓解期小鼠组，在缓解期记录小鼠临床评分，颈部脱臼处死小鼠取小鼠胸腺，制成单细胞悬液，用牛鲍计数板计数细胞总数；然后计数1×106个细胞，进行荧光抗体染色，标记CD4-FITC、CD8-PE，30 min，4℃避光孵育，进行流式检测(BD FACS Calibur)。

2结果

2.1EAE小鼠模型诱导成功C57BL/6小鼠双侧背部皮下MOG35-55肽乳化剂免疫，尾静脉注射PT后，EAE小鼠病程经历进展期，到达发病高峰期，出现典型的运动系统障碍的症状，EAE小鼠发病高峰期脊髓组织切片HE染色显示大量炎性细胞浸润(图1A、B)；以上表明EAE小鼠模型诱导成功。对所有的实验小鼠进行统计发现EAE诱导发病率达100%，在后期统计中对所有EAE小鼠进行分析，EAE发病高峰期小鼠疾病临床评分分布：0.5分的2只，1.0分的6只，1.5分的2只，2.0分的11只，2.5分的2只，3.0分的14只，3.5分的3只，4.0分的5只，5.0分的无。

2.2EAE小鼠胸腺淋巴细胞数与疾病严重程度的关系计数EAE小鼠发病高峰期胸腺淋巴细胞，尾部无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(20.25±3.49)×106个，双后肢无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(4.93±0.85)×106个，双后肢瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(1.8±0.19)×106个，四肢完全瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(0.52±0.07)×106个，EAE小鼠胸腺淋巴细胞数与疾病严重程度关系密切。随着EAE小鼠疾病严重程度的增加，胸腺淋巴细胞数量减少，组间差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.3胸腺淋巴细胞亚群与疾病严重程度的关系以EAE小鼠临床评分分析胸腺淋巴细胞亚群的比例变化。其中临床评分1.0分的小鼠6只，2.0分的小鼠11只，3.0分的14只，4.0分的2只；流式细胞分析发现，EAE小鼠临床评分越高，胸腺CD4+CD8+双阳性细胞比例越低，同时CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例增高(图3A)。胸腺中CD4+CD8+双阳性细胞与CD4+CD8-和CD4-CD8+单阳性细胞与EAE小鼠疾病严重程度关系密切，EAE疾病越重，CD4+CD8+双阳性细胞比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例越高(图3B)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

图2　EAE小鼠不同临床评分胸腺淋巴细胞数比较Fig.2　Comparing different clinical scoring number of thymocytes in EAE mice

图3　EAE小鼠不同临床评分及对照组小鼠胸腺细胞流式分析Fig.3　EAE group in different clinical score and control group result of flow cytometry of thymocyte

2.4EAE小鼠胸腺具有可复性研究EAE小鼠病程周期中胸腺细胞的变化规律，对发病高峰期EAE小鼠评分为4.0分的小鼠进行分组：EAE高峰期小鼠组2只和EAE缓解期小鼠组3只；EAE高峰期小鼠组小鼠处死，EAE缓解期小鼠组小鼠继续观察，发现3只全部进入缓解期，其中1只缓解期评分为2.0分，另外2只评分为1.0；选择缓解期评分为1.0的小鼠与EAE高峰期小鼠组胸腺淋巴细胞计数进行比较，小鼠在发病高峰期胸腺淋巴细胞数显著低于缓解期(P<0.01)(图4)；流式细胞分析发现，进入缓解期的EAE小鼠胸腺淋巴细胞中CD4+CD8+双阳性细胞比例回升，CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例降低，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

图4　EAE小鼠发病高峰期和缓解期胸腺淋巴细胞数变化Fig.4　Change of peak and remission EAE mice thymocyte numberNote:*.P<0.01,one-way ANOVA.

3讨论

EAE是一种广泛使用的作为自身免疫病MS的动物模型[3]。EAE小鼠的中枢神经系统炎性脱髓鞘组织病理特点与MS相似。EAE发病高峰期，胸腺萎缩[2]。作为中枢免疫器官，胸腺维持机体免疫功能正常及免疫细胞发育成熟。胸腺易萎缩，Hirokawa等[4]发现胸腺萎缩与年龄关系密切，C57BL/6小鼠在成年后，随年龄增长，胸腺重量减轻，体积减小，淋巴细胞减少。营养不良、应激、创伤都可导致胸腺萎缩[5]。而T淋巴细胞主要在胸腺中发育成熟，从来自骨髓的多能干细胞开始，经历DN、DP、SP阶段，通过阳性选择和阴性选择，无能T淋巴细胞和自身反应性T淋巴细胞以凋亡的形式被清除，有5%左右的T淋巴细胞发育成熟，释放到外周发挥免疫功能,这些成熟的T细胞具备免疫反应性和自身免疫耐受的特点。

前期研究发现，EAE小鼠胸腺萎缩，细胞凋亡，其中主要凋亡细胞群是CD4+CD8+双阳性细胞。在EAE中胸腺萎缩细胞凋亡，其与疾病严重程度的关系研究未见报道。我们利用发病高峰期疾病严重程度不同的EAE小鼠，探究胸腺萎缩情况，根据疾病严重程度，分析胸腺中不同淋巴细胞亚群的比例，以期掌握胸腺萎缩与疾病严重程度的关系，为进一步研究EAE发病机制及自身免疫病胸腺萎缩机制提供参考。

我们的实验结果显示，EAE小鼠中尾部无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(20.25±3.49)×106个，双后肢无力小鼠胸腺淋巴细胞数为(4.93±0.85)×106个，双后肢瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(1.8±0.19)×106个，四肢完全瘫痪小鼠胸腺淋巴细胞数为(0.52±0.07)×106个，EAE疾病越重，胸腺淋巴细胞数量越少。胸腺萎缩与疾病严重程度关系密切；流式分析显示随疾病严重程度的增加，CD4+CD8+双阳性细胞比例逐渐降低，CD4+CD8-、CD4-CD8+单阳性细胞比例逐渐升高，胸腺淋巴细胞亚群比例与疾病严重程度关系密切。Savino等[6]研究发现急性感染可导致胸腺萎缩，在急性感染免疫中，大量免疫细胞激活，迁移至炎症部位，导致胸腺萎缩。在EAE发病高峰期，大量免疫细胞活化，据此推测可能导致胸腺萎缩的机制与急性感染相似。Yoh等[7]发现活化的T细胞迁移到中枢神经系统是导致EAE发病的主要原因，Martinez等[8]认为在中枢神经系统中Th1通过转录因子T-bet,分泌炎性细胞因子如IFN-γ，参与EAE的发病。又有学者发现Th17表达RORγt,分泌炎性细胞因子IL-17、IL-21、IL-22和TNF-α,在MS和EAE的发病过程中起关键作用[9]。上述学者的研究证实大量免疫细胞在中枢神经系统的聚集、活化及细胞因子的分泌，导致EAE的发生。EAE活跃阶段，外周接触髓鞘抗原活化的髓鞘抗原特异性T细胞，迁移至中枢神经系统。一旦进入中枢神经系统，这些活化的T细胞就会再次接触髓鞘抗原，启动炎症免疫反应导致炎性脱髓鞘。在EAE发病过程中，MOG肽抗原特异性T细胞(MOG-T细胞)产生，进入中枢神经系统，引起临床症状，而随着MOG-T细胞进入中枢神经系统增加，小鼠脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘加剧，疾病严重程度加重，因此疾病严重程度与中枢神经系统中浸润的MOG-T细胞的数量关系密切。据此我们推测在EAE发病过程中，MOG-T细胞穿过血脑屏障迁移至中枢神经系统，破坏髓鞘释放MOG肽，这一过程加速了T细胞的活化和迁移过程，进而加速胸腺中的T细胞发育过程，加速T细胞发育过程中的阳性选择和阴性选择，DP细胞凋亡加速，促使更多的成熟T细胞释放到外周，接受抗原递呈细胞递呈的MOG肽，活化为MOG-T细胞迁移至中枢神经系统，形成正向的级联放大效应。因此疾病严重程度可能决定胸腺萎缩程度，活化T细胞的迁移可能导致胸腺的萎缩。萎缩胸腺的可复性也早有报道[10]，对胸腺的可复性进行研究发现，随着EAE小鼠病情的缓解，胸腺萎缩减轻，细胞凋亡减少，这进一步验证了上面的结果。综上所述，EAE小鼠疾病严重程度与胸腺萎缩程度关系密切，EAE小鼠中活化T细胞的定向迁移可能导致胸腺萎缩。

我们同时观察到，在EAE小鼠发病高峰期胸腺淋巴细胞的CD4-CD8-双阴性阶段，随着疾病严重程度的加重,双阴性细胞比例呈现先升高后降低的趋势，CD4-CD8-双阴性细胞亚群凋亡在EAE小鼠中的变化是我们下一步研究的重点。

参考文献：

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[2]Tsunoda I,Libbey JE,Kuang LQ,etal.Massive apoptosis in lymphoid organs in animal models for primary and secondary progressive multiple sclerosis[J].Am J Pathol，2005，167(6):1631-1646.

[3]Constantinescu CS,Farooqi N,O′Brien K,etal.Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS)[J].Br J Pharmacol，2011，164(4):1079-1096.

[4]Hirokawa K,Utsuyama M,Kobayashi S.Hypothalamic control of development and aging of the thymus[J].Mech Ageing Dev，1998，100(2):177-185.

[5]Savino W,Dardenne M,Velloso LA,etal.The thymus is a common target in malnutrition and infection[J].Br J Nutr，2007，98(Suppl 1):S11-S16.

[6]Savino W.The thymus is a common target organ in infectious diseases[J].PLoS Pathog，2006，2(6):e62.

[7]Yoh K,Morito N,Ojima M,etal.Overexpression of RORgammat under control of the CD2 promoter induces polyclonal plasmacytosis and autoantibody production in transgenic mice[J].Eur J Immunol，2012，42(8):1999-2009.

[8]Martinez NE,Sato F,Omura S,etal.RORgammat,but not T-bet,overexpression exacerbates an autoimmune model for multiple sclerosis[J].J Neuroimmunol,2014,276(1-2):142-149.

[9]Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:the Th17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

[10]Zhang N,Hartig H,Dzhagalov I,etal.The role of apoptosis in the development and function of T lymphocytes[J].Cell Res，2005，15(10):749-769.

[收稿2015-03-20修回2015-06-05]

(编辑倪鹏)