电针对糖尿病大鼠胰腺组织CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达及胰腺超微结构的影响

邵　俊，查必祥，袁爱红，杨　骏，张金静，薛秋菊，翟静静

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥　230031；

2.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥　230038)



电针对糖尿病大鼠胰腺组织CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达及胰腺超微结构的影响

邵俊1，查必祥1，袁爱红1，杨骏1，张金静1，薛秋菊2，翟静静2

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031；

2.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的观察针刺对糖尿病大鼠胰腺组织内质网应激及细胞凋亡的影响。方法高脂高糖饲料喂养加低剂量链脲佐菌素腹腔注射复制糖尿病大鼠模型，按血糖分层将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、针刺组和二甲双胍组，另设空白组。干预4周后检测随机血糖、大鼠胰腺组织CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量，观察胰腺细胞超微结构。结果模型复制后，模型复制组随机血糖显著高于空白组(P<0.05)。针刺组和二甲双胍组随机血糖均较治疗前明显降低(P<0.05)；与模型组比较，针刺组随机血糖水平呈降低趋势(P>0.05)。模型组CHOP、Bax蛋白含量明显高于空白组(P<0.05)，Bcl-2蛋白含量显著低于空白组(P<0.05)；模型组、针刺组和二甲双胍组CHOP、Bax蛋白含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；针刺组和二甲双胍组Bcl-2蛋白含量均显著高于模型组(P<0.05)。针刺组和二甲双胍组胰腺细胞线粒体排列整齐，在空泡变性，线粒体嵴断裂，粗面内质网变形，糖原颗粒减少方面，其异常变化较模型组明显减轻。结论针刺可通过改善糖尿病大鼠胰腺组织内质网应激，良性调节Bcl-2、Bax蛋白含量，从而保护胰腺细胞。

[关键词]糖尿病；链脲佐菌素；针刺；CHOP；Bax；Bcl-2

内质网应激是指由多种因素如高糖高脂、低氧、化学毒物等使内质网腔内Ca2+耗竭、蛋白质糖基化抑制、二硫键错配以及内质网内蛋白质向高尔基体转运减少，导致未折叠蛋白和(或)错误折叠蛋白质在内质网腔内蓄积以及打破Ca2+的平衡状态，从而使内质网功能发生改变。内质网应激在2型糖尿病的发生和发展过程中发挥了重要作用[1]，其启动的凋亡途径是近几年来新发现的一种凋亡途径。CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)是该凋亡途径相关的凋亡信号分子中最重要的成员之一。针刺是否可以通过对CHOP蛋白的调节而改善内质网应激，从而抑制胰腺细胞凋亡？本研究将对此进行探讨。

1材料

1.1实验动物SPF级健康雄性SD大鼠80只，购于安徽医科大学动物实验中心，体质量(220±20)g，实验动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。饲养在安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室动物饲养房，室温为(27±3)℃，相对湿度为(55±5)%，保持通风，自由饮水和摄食。

1.2主要仪器和试剂血糖仪及试纸：美国强生公司；LX 300型微量离心机：江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司；EPS 300型电泳仪：Tanon公司；H-7500型透射电镜：Hitachi日立公司；G6805Ⅱ型电针仪：江苏省苏州医疗器械有限公司；华佗牌针灸美容针：苏州天协针灸器械有限公司。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：美国Sigma公司；戊二醛：北京化学试剂公司；ECL超敏发光试剂盒：美国Thermo公司；RIPA细胞裂解液(强)：碧云天生物技术研究所。

2方法

2.1动物分组电脑随机数字法选取10只大鼠作为空白组，全价鼠饲料喂养；剩余70只大鼠高糖高脂饲料(饲料配制于安徽医科大学实验动物中心)喂养4周后，连续2 d腹腔注射小剂量STZ 30 mg/kg，注射前均禁食12 h，注射后继续高糖高脂饲料喂养1周后，尾静脉采血测随机血糖，血糖大于16.7 mmol/L提示模型复制成功，即STZ糖尿病大鼠，共30只(称为“模型复制组”以区别后文“模型组”)，将其按血糖分层随机分为模型组、针刺组和二甲双胍组，每组10只。

2.2干预方法①针刺组：将大鼠以自制固定器固定，75%乙醇棉球无菌操作穴位，采用一次性无菌针灸针(规格：0.18 mm×13 mm)针刺，刺入2～4 mm深，小幅度持续匀速捻转1 min，后三里和内庭穴接通G6805 Ⅱ型电针仪(连续波，1 mA，10 Hz)。每次取一侧肢体，两侧肢体轮流选取，每次治疗15 min，每日针刺1次，7次为1个疗程，共4个疗程。二甲双胍组：根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”确定大鼠的灌胃药量，二甲双胍100 mg/kg，研磨成粉末，与蒸馏水(加温)混合成20 mg/mL的溶液，按大鼠体质量所需要的药物量进行灌胃给药。每日灌胃1次，疗程与针刺组平行。②模型组和空白组：与针刺组同样固定，但不作任何处理，疗程与针刺组平行。干预期间各组大鼠均自由摄食、饮水，4组均为SPF级全价鼠饲料。

2.3观察指标及方法干预4周后，用美国强生型血糖仪测随机血糖，用10%水合氯醛腹腔麻醉后置冰碟上，快速取出胰体、胰尾，用0.9%生理盐水冲洗，纱布吸干后放入EP管中，置液氮中保存。另每组取1只大鼠的胰体、胰尾置2.0%戊二醛中固定。

2.3.1胰腺组织CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量检测称取胰腺组织进行细胞裂解、匀浆、离心，取其上清液，向上清液中加入等量的2倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，加热变性后冷却，通过电泳、转膜、封闭后进行一抗孵育(兔抗，1∶800稀释)和二抗孵育(1∶10 000稀释)，最后采用ECL化学发光，置定影液中进行定影。

2.3.2胰腺细胞的电镜观察取出胰腺组织，浸泡固定2 h(4 ℃，pH=7.2)，修切成1 mm×1 mm×3 mm大小的组织块后，用0.07 mol/L PBS、0.19 mol/L蔗糖缓冲液充分清洗，再用1.0%锇酸、0.24 mol/L PBS后固定2 h，漂洗、梯度乙醇脱水，浸泡过夜，次日从37 ℃(12 h)、45 ℃(12 h)到60 ℃(12 h)依次进行加温聚合，再行超薄切片，最后经醋酸铀和枸橼酸铅电子染色，用Hitachi-7500型透射电镜观察和摄像。

3结果

3.1一般情况STZ注射后1周，模型复制组大鼠饮水量、进食量及尿量较前明显增多。实验过程中，空白组大鼠精神状态良好，反应灵敏，毛发平伏亮泽，体质量逐渐增加；模型组大鼠精神萎靡，毛发枯黄，多数出现尾部及指甲溃烂、大便干结等表征，体质量均明显减轻，死亡2例；针刺组、二甲双胍组大鼠的精神状况较空白组稍差，但明显好于模型组，饮水量、饮食量及尿量较模型组有所减少，体质量较治疗前没有明显减轻，毛发光亮，未见尾部及指甲溃烂。

3.2随机血糖变化模型复制前，模型复制组与空白组随机血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型复制后，模型复制组随机血糖显著高于空白组(P<0.05)。见表1。治疗前，模型组、针刺组和二甲双胍组随机血糖水平显著高于空白组(P<0.05)；治疗后，模型组和空白组较干预前随机血糖均有所升高，但差异均无统计学意义(P>0.05)，针刺组和二甲双胍组随机血糖均较治疗前明显降低(P<0.05)；二甲双胍组随机血糖降低值显著大于模型组(P<0.05)。见表2。

表1　模型复制前后两组大鼠随机血糖比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05；

与同组模型复制前比较，#P<0.05。

表2　实验干预前后各组大鼠随机血糖比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05；与同组治疗前相比，#P<0.05；与模型组差值比较，△P<0.05。

3.3各组大鼠胰腺组织CHOP、Bax、Bcl-2蛋白含量比较模型组CHOP、Bcl-2蛋白含量明显高于空白组(P<0.05)，Bax蛋白含量显著低于空白组(P<0.05)；模型组、针刺组和二甲双胍组CHOP、Bax蛋白含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；针刺组和二甲双胍组Bcl-2蛋白含量均显著低于模型组(P<0.05)。见表3、图1。

表3　各组大鼠胰腺组织CHOP、Bax、Bcl-2表达水平比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

注：1.空白组；2.模型组；3.针刺组；4.二甲双胍组。

3.4电镜下各组大鼠胰腺细胞形态学观察空白组大鼠胰腺细胞可见丰富而排列整齐的线粒体，线粒体嵴密集清晰，呈同心圆排列；粗面内质网丰富，清晰呈条索状；细胞浆周围有多量聚集成堆的酶原颗粒，凸向细胞浆。提示空白组胰腺细胞形态未受到明显破坏。模型组可见少量散在分布的线粒体，出现不同程度的空泡变性、嵴距离明显扩张及断裂；粗面内质网扩张、断裂，核染色质有边集浓染现象；酶原颗粒明显减少。提示模型组胰腺细胞受到明显的破坏。针刺组线粒体排列较整齐，少数出现不同程度的空泡变性、肿胀、嵴扩张，未见嵴断裂；粗面内质网略有扩张、变形，少数出现断裂，排列较规律；酶原颗粒丰富，散在分布在细胞浆周围。提示针刺组大鼠胰腺细胞形态异常明显轻于模型组，但仍未恢复到空白组水平。二甲双胍组线粒体数目正常，部分出现空泡变性、嵴轻度扩张，未见嵴断裂，细胞核边集；少量粗面内质网扩张、断裂，排列紊乱；酶原颗粒略减少，散在分布在细胞浆周围。提示二甲双胍组大鼠胰腺细胞形态异常明显轻于模型组，但仍未恢复到空白组水平。见图2。

4讨论

内质网应激启动的凋亡是近年来新发现的一种凋亡途径，与该途径相关的重要凋亡信号分子有很多，CHOP是其中最重要的成员之一。CHOP/生长抑制和DNA损伤诱导基因153是内质网应激特异的转录因子[2]，是一个由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子。研究显示，生理状态下CHOP表达水平十分低下，出现内质网应激时CHOP被大量激活，CHOP的持续升高通过影响细胞内钙的代谢和改变Bcl家族成员来启动细胞凋亡[3-6]。CHOP可上调促凋亡基因bax/bak，同时下调抗凋亡基因bcl-2。过表达的CHOP会导致胞质内Bax/Bak向线粒体转移，并引起定位于内质网膜上的Bax/Bak构象发生改变，最终可破坏内质网膜的完整性，导致Ca2+向胞质外流。Bcl-2蛋白表达的减少可增加线粒体对促凋亡因子的敏感性[5]，最终启动Caspase级联反应[6]。

针灸治疗2型糖尿病疗效显著，可控制和改善并发症。既往研究显示，针刺具有调控脂肪细胞因子[7]、干预胰岛素信号[8]以及保护胰岛β细胞形态和功能[9]等作用，从而治疗2型糖尿病。本研究显示，糖尿病大鼠胰腺组织CHOP蛋白表达较空白组明显升高，针刺治疗可以显著降低CHOP蛋白表达，与二甲双胍水平相当。说明糖尿病大鼠胰腺组织存在着CHOP介导的内质网应激，而针刺治疗可有效干预CHOP的蛋白表达，从而改善内质网应激，这可能是针刺治疗2型糖尿病的作用机制之一。糖尿病大鼠胰腺细胞Bax蛋白表达较空白组显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，针刺治疗可有效下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达(P<0.05)，说明针刺治疗可显著抑制糖尿病大鼠胰腺细胞凋亡。电镜结果显示，模型组胰腺细胞明显受损，针刺组和二甲双胍组胰腺细胞形态较模型组有明显好转，但仍不及空白组，提示针刺治疗可有效保护糖尿病大鼠胰腺组织的细胞形态。同时，针刺组CHOP蛋白表达与模型组相比有下降趋势却无统计学意义，但与二甲双胍在同一水平，这可能与针刺治疗的调节有限性或治疗的疗程长短有关，需进一步研究。针刺对STZ诱导的糖尿病大鼠有着明显的降糖作用，这与笔者既往研究[10]相似。但从其降糖效应与模型组比较，差异无统计学意义，同时其降糖效应又与二甲双胍组同当，这可能与样本量不足或疗程较短有关，有待下一步研究。

糖尿病属中医学“消渴”范畴，本实验选用了后三里、内庭和胰俞3个穴位治疗，后三里为足阳明胃经合穴，且为胃的下合穴。早在《素问·阴阳别论》就认为“二阳结谓之消”，又指出“二阳者，阳明也”。胃中热盛，阴津枯竭，水谷即消。内庭为足阳明胃经荥穴，《难经·六十八难》有“荥主身热”，而消渴病正是以阴虚为本，燥热为标。后三里配内庭可清泄阳明之热。胰俞为治疗消渴病的经外奇穴，又名胃管下输，首见于《备急千金要方》，其主治“消渴咽喉干、口干”，现仍为临床治疗糖尿病的特效穴位。三穴配伍经本课题组前期研究[11]已经证实对于糖尿病具有良好的疗效。

参考文献:

[1]Rieusset J. Mitochondria and endoplasmic reticulum: mitochondria-endoplasmic reticulum interplay in type 2 diabetes pathophysiology[J]. Int J Biochem Cell Biol，2011，43(9)：1257-1262.

[2]Oyadomari S，Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ，2004，11(4):381-389.

[3]Lin JH，Li H，Yasumura D，et al. IRE1 signaling affects cell fate during the unfolded protein response [J].Science，2007，318(5852):944-949.

[4]Timmins JM，Ozcan L，Seimon TA，et al. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ links ER stress with Fas and mitochondrial apoptosis pathways[J]. J Clin Invest，2009，119(10):2925-2941.

[5]高小玲，罗子国.双氢青蒿素诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及其机制研究[J].中草药，2010，41(1)：9-13.

[6]Wu J，Kaufman RJ. From acute ER stress to physiological roles of the unfolded protein response[J].Cell Death Differ，2006，13(3):374-384.

[7]袁爱红，刘志诚，魏群利，等.针刺2型糖尿病大鼠脂肪细胞因子的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(20): 3915-3919.

[8]马建华，王昱政，赵琳.针刺对2型糖尿病肥胖大鼠瘦素、胰岛素抵抗和脂联素水平影响的实验研究[J].新中医，2012，44(11):134-137.

[9]孙志，韩海荣，马丽，等.针刺对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞形态学影响[J].中华中医药杂志，2010，25(12):1971-1974.

[10]袁爱红，鲍淘淘，倪英群，等.针刺对糖尿病大鼠下丘脑弓状核IRS1/PI3K途径的影响[J].中国老年学杂志，2014，9(34)：5145-5148.

[11]高大红.针刺对2型糖尿病大鼠下丘脑GLUT3和GLUT4基因和蛋白的影响[D].合肥：安徽中医药大学，2012.

·针灸经络·

Effects of Electroacupuncture on Protein Expression of CHOP, Bax, and Bcl-2 in Pancreatic Tissue and Ultrastructure of Pancreas in Diabetic Rats

SHAOJun1,ZHABi-xiang2,YUANAi-hong1,YANGJun1,ZHANGJin-jing2,XUEQiu-ju2,ZHAIJing-jing2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on endoplasmic reticulum stress and cell apoptosis in the pancreatic tissue of diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was induced by high-fat and high-sugar feeding and intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group, acupuncture group, and metformin group according to blood glucose stratification; in addition, healthy rats were assigned to blank group. After 4 weeks of treatment, the levels of random blood glucose and proteins (Bax, Bcl-2, and CHOP) were determined, and the ultrastructure of pancreas was observed. ResultsAfter the model was established, the content of random blood glucose in the model group was significantly higher than that in the blank group (P<0.05). The acupuncture group and metformin group showed significant decreases in random blood glucose after treatment (P<0.05); compared with the model group, the acupuncture group showed a nonsignificant decrease in random blood glucose (P>0.05). Compared with the blank group, the model group had significantly higher levels of CHOP and Bax (P<0.05) but a significantly lower Bcl-2 level (P<0.05); there were no significant differences in the content of CHOP and Bax between the model group, acupuncture group, and metformin group (P>0.05); the content of Bcl-2 in the acupuncture group and metformin group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). When compared with the model group, the acupuncture group and metformin group had significantly reduced abnormal changes with respect to vacuolar degeneration, rupture of mitochondrial cristae, rough endoplasmic reticulum deformation, and reduction in glycogen granules. ConclusionAcupuncture can improve the endoplasmic reticulum stress in the pancreas of diabetic rats and regulate the content of Bcl-2 and Bax, thus protecting pancreatic cells.

[Key words]diabetes; streptozotocin; acupuncture; CHOP; Bax; Bcl-2

收稿日期：(2015-05-10；编辑：曹健)

通信作者：袁爱红，yuanah2004@aliyun.com

作者简介：邵俊(1980-)，男，主治医师

基金项目：国家自然科学青年基金项目(81202769)

[中图分类号]R587.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.017