京大戟中二萜类化合物pekinenal对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

陈飞燕，陶伟伟,,，陈扣玉，张嘉卿，王雨青，陈　刚，段金廒

(南京中医药大学1.基础医学院实验研究中心；2.中医脑病重点实验室；3. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏 南京　210023)



京大戟中二萜类化合物pekinenal对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

陈飞燕1，陶伟伟1,2,3，陈扣玉2，张嘉卿2，王雨青2，陈刚2，段金廒3

(南京中医药大学1.基础医学院实验研究中心；2.中医脑病重点实验室；3. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏 南京210023)

摘要:目的研究京大戟中二萜类化合物pekinenal对肝癌SMMC-7721细胞增殖、周期和凋亡的影响，并初步探讨其治疗肝癌可能的影响机制。方法采用MTT法分析不同浓度的pekinenal对体外培养SMMC-7721细胞增殖的影响；采用原位末端标记法(TUNEL)、Annexin V/PI 双染法和电镜观察对细胞凋亡的作用；应用流式细胞术分析对细胞周期的影响。结果MTT结果显示，pekinenal可明显抑制SMMC-7721细胞的增殖，呈浓度依赖性。Annexin V/PI 双染法结果显示，随着pekinenal浓度的增加，肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率明显增加，与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。TUNEL法检测结果表明，不同浓度的pekinenal作用于SMMC-7721细胞后均可诱导肝癌细胞凋亡，凋亡指数(AI)随着药物浓度的升高明显增加(P<0.01)。给药后电镜观察，与对照组比较，发现肝细胞线粒体肿胀、内质网扩张，胞质包涵体形成，部分细胞核呈现凋亡表现，并且随着药物浓度增加，凋亡现象越明显。流式细胞术分析显示，不同浓度的pekinenal均可使细胞被阻滞于S期。结论pekinenal对人肝癌细胞增殖有明显地抑制作用，并存在着明显的浓度依赖关系；pekinenal可能是通过抑制癌细胞DNA的合成，将人肝癌细胞周期阻滞在S期，抑制其增殖，通过诱导人肝癌细胞发生凋亡等，发挥其抗肝癌作用。

关键词：京大戟；pekinenal；SMMC-7721；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡

原发性肝癌发病率高，早期不易发现，确诊时约90%已属中晚期，而大多数化疗药物因副作用较大，患者难以接受大剂量治疗[1]。京大戟为大戟科Euphorbiaceace大戟属Euphorbiagenus植物大戟EuphorbiapekinensisRupr.的干燥根[2]。始载于《神农本草经》，列为下品，为中医临床常用的峻下逐水药，性寒，味苦、有毒[3]。归肺、脾、肾经。临床上常用于胸膜炎积水、晚期血吸虫病腹水、肝硬化腹水及精神分裂症等[4]。pekinenal是课题组前期从京大戟中分离提取出来具有抗癌作用的二萜类化合物[5]，目前对其抗肿瘤作用机制尚未见报道。本研究针对化合物pekinenal对肝癌SMMC-7721细胞增殖、周期及凋亡作用的影响，探讨其对肝癌可能的作用机制。

1材料

1.1细胞株人肝癌细胞株SMMC-7221购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2主要药品与试剂化合物pekinenal：由本实验室从京大戟中分离得到。京大戟药材购于安徽省亳州市药材总公司，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为大戟科大戟属植物大戟EuphorbiapekinensisRupr.的干燥根；MTT(solarbio，批号321E054)；原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒(Roche，批号11684795910)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号1221119)；DMSO(Sigma 公司，批号 302A0324)；RPMI 1640培养基(Gibco，批号8114281)；Alexa Fluor 488 Annexin V and PI细胞凋亡检测试剂盒(Invitrogen，批号V1324)。

2方法

2.1MTT法观察pekinenal对SMMC-7721细胞增殖的影响取对数生长期SMMC-7721细胞，消化制成单细胞悬液后，以3×107·L-1浓度接种于96孔板内，100 μL/孔，在37 ℃、含体积分数为0.05的饱和湿度条件下的培养箱中培养24 h。小心吸弃上清，以每孔100 μL依次加入所配备好不同浓度的药物pekinenal，空白对照组加入等体积的细胞培养液，每组设5个复孔。置37 ℃、含体积分数为0.05的饱和湿度条件下的培养箱中培养48 h后，每孔加入MTT( 5 g·L-1) 20 μL，继续孵育培养4 h后，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，将板子置于摇床上低速振荡10 min，酶标仪492 nm波长处检测各孔吸光度，按公式计算pekinenal对SMMC-7721细胞的生长抑制率，抑制率(IR)：IR%=(1-A药物组均值/A空白对照组均值)×100%。根据实验结果，选择合适的pekinenal浓度，继续后续实验。

2.2Annexin V/PI染色检测pekinenal对SMMC-7721细胞凋亡的影响以 6.25、12.5、50 μmol·L-1pekinenal处理肝癌SMMC-7721细胞48 h，分别消化收集各组细胞，调整细胞密度至1×109·L-1，4 ℃ PBS洗涤2次，弃上清液。加入预冷的结合缓冲液100 μL重悬细胞，置冰浴。加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI于细胞悬液中，轻轻混匀；将试管置于室温避光染色15 min。补加 400 μL结合缓冲液混悬细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。实验重复3次。

2.3原位末端标记法(TUNEL)观察各组SMMC-7721细胞凋亡情况将制备好的细胞标本根据MTT实验结果选择的浓度加药，实验组分别加入等量浓度为 6.25、12.5、50 μmol·L-1的pekinenal，阴性对照组加等量PBS液，培养48 h后捞片。按说明书经TUNEL法染色后，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明树胶封片，镜检。光镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈黄褐色。10×10低倍镜下随机选取5个细胞均匀分布的视野，10×20中倍镜下每个视野随机选50个细胞计数凋亡细胞数目和总的细胞数目，计算凋亡指数(AI)。AI/%=凋亡细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次。

2.4透射电镜观察pekinenal对SMMC-7721细胞凋亡的影响为观察给药后SMMC-7721细胞凋亡的超微结构特点，以 6.25、12.5、50 μmol·L-1pekinenal处理肝癌SMMC-7721细胞48 h，用细胞刮收集细胞，与培养液一起离心，弃上清，含体积分数为0.025的戊二醛固定液固定细胞团块2 h，0.1 mol·L-1PBS洗涤3次，含体积分数为0.01的锇酸固定2 h，0.1 mol·L-1PBS洗涤3次，梯度浓度酒精、丙酮脱水，618环氧树脂浸透包埋,超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色，透射电镜下观察，拍照片。

2.5流式细胞术分析药物对SMMC-7721细胞周期的影响将制备好的细胞分组后，根据MTT实验结果选择的浓度加入pekinenal，于37 ℃、含体积分数为0.05的饱和湿度条件下培养48 h。含体积分数为0.0025的胰蛋白酶消化后，收集细胞离心1 000 r·min-1×10 min，弃上清液，将离心出的细胞PBS洗涤2次，1 000 r·min-1×10 min离心后，吸尽上清液，用200 μL结合缓冲液悬浮细胞，分别加入10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI混匀，避光4 ℃反应30 min，再加入300 μL结合缓冲液，立即于流式细胞仪检测。实验重复3次。

3结果

3.1pekinenal对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用由不同浓度pekinenal作用SMMC-7721细胞48 h后细胞增殖抑制率的结果由Tab1可见，MTT法检测结果表明，pekinenal对肝癌SMMC-7721细胞有明显增殖抑制的作用，该作用具有剂量依赖性，即随着药物作用剂量的增加，对细胞的抑制作用逐渐增强。根据Tab1可见，当药物浓度为25 μmol·L-1时，抑制率已过半，因此后续实验选取6.25、12.5和50 μmol·L-13个浓度观察细胞周期和凋亡。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

3.2pekinenal诱导SMMC-7721细胞凋亡不同浓度pekinenal作用SMMC-7721细胞48 h后，收集对照组和药物组细胞，Annexin V/PI 染色检测细胞凋亡率。结果如Fig 1和Tab2所示，6.25、12.5和50 μmol·L-1的pekinenal作用后，细胞的凋亡率分别为(12.13±0.03)% 、(28.02±0.1) % 和(72.34±0.1)%，呈剂量依赖性，与对照组比，差异具有明显统计学意义(P<0.01 )。

3.3TUNEL法观察药物作用48 h后对SMMC-7721细胞凋亡的影响选择6.25、12.5和50 μmol·L-1的pekinenal作用于SMMC-7721细胞，48 h后用TUNEL法检测细胞核的染色情况。光镜下观察凋亡细胞的细胞核呈塌陷固缩，被染上深褐色(Fig 2)。空白对照组几乎没有细胞核被染上深褐色，因此在苏木精复染时被染上了淡紫色。在药物组中，由于染色过程中一些非特异性吸附，也有较多细胞被染上褐色，但是仔细鉴别可以发现，只有凋亡细胞的细胞核不但染成深褐色，而且颜色深，体积较小，符合凋亡时细胞核固缩的特征。计算凋亡指数(AI)后显示，不同浓度的pekinenal均能引起细胞凋亡，而且随着浓度的增高，凋亡率明显增加。

3.4电镜观察结果空白对照组未能检测到凋亡细胞，实验组检测到凋亡细胞存在，其超微结构如Fig 3所示。从照片上可以看出，正常SMMC-7721细胞结构清晰完整，核膜完整，核染色质颗粒细致，分布均匀。凋亡细胞的染色质固缩，呈斑状及块状聚集在核膜周边，胞质浓缩，核膜皱折，细胞器结构完整，出现透明的空泡。

A:Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal; C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal; D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

**P<0.01vscontrol

A: Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal; C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal; D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal.**P<0.01vscontrol

3.5pekinenal对SMMC-7721细胞周期的影响6.25、12.5 和 50 μmol·L-1的pekinenal作用SMMC-7721细胞48 h后，用流式细胞仪进行细胞周期分析，结果显示，不同浓度的pekinenal均能使S期细胞的比例明显升高，G1/G2期细胞的比例下降，细胞被阻滞于S期。见Tab3、Fig 4。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

4讨论

恶性肿瘤共同的生物学特征为失控性生长，其主要分子机制是由于细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡减少，因此抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一[1]。原发性肝癌是世界上死亡率第三的恶性肿瘤，由于我国大量乙型肝炎感染人群的存在，肝癌在我国高发，治疗效果一直不理想[6]。近年来，顺铂等新化疗药物的应用虽然大大提高了肿瘤细胞对药物的敏感性，但临床治疗效果仍然不甚满意[7]。中草药作为我国传统药物，以其药物温和、毒性作用小的特点，受到临床的广泛关注和应用。现今越来越多的研究证实，中药提取物在抗肿瘤方面有着不容忽视的作用。

A: Control group;B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal；C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal；D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

A: Control group; B: Treated with 6.25 μmol·L-1pekinenal；C: Treated with 12.5 μmol·L-1pekinenal；D: Treated with 50 μmol·L-1pekinenal

大戟属植物中富含的二萜类化合物具有很强的生物活性，有报道指出二萜是五类最有希望的抗癌活性成分之一。贾忠建等[8-9]对从大戟属植物准葛尔大戟、甘遂大戟、甘青大戟等种植物中得到的千金二萜烷型和巨大戟烷型二萜单体进行研究，发现对肝癌SMMC-7721、肺腺癌L342、胃腺癌MGc80-3的生长有明显增殖抑制作用。刘桂芳等[10]对狼毒大戟中的二萜内酯类成分进行了实验研究，结果表明其二萜内酯类均有不同程度抑制S180、艾氏腹水癌及肝癌腹水等癌细胞生长的活性。大戟注射液具有抑制癌细胞DNA合成作用，对于正常人骨髓粒单细胞集落(GM-CFU)的抑制作用明显低于高三尖杉酷碱的抑制作用。文成英等以大戟注射液为实验用药，对KY821细胞株及12例正常人骨千细胞进行体外药物实验，尚溪碱等对L615白血病小鼠进行了体内的药物实验研究，观察细胞动力学，实验证明了大戟注射液具有抑制癌细胞DNA合成作用[11]。二萜类化合物pekinenal是从京大戟中分离提取出的活性物质，但对其抗癌作用机制至今尚未报道。

本研究通过MTT法发现，pekinenal对肝癌SMMC-7721细胞株的增殖有明显抑制作用。随着pekinenal浓度的增加，对SMMC-7721细胞株的抑制率逐渐上升，说明它的抑制作用具有一定的剂量依赖性。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、消退等存在着密切的联系。肝癌的迅速生长是癌细胞增殖与凋亡调控失衡的结果。诱导肝癌细胞凋亡是肝癌治疗的重要方法之一。本研究通过TUNEL法、Annexin V/PI染色检测和电镜观察了pekinenal对肝癌细胞凋亡的影响，结果表明， pekinenal能诱导SMMC-7721细胞凋亡，且随着pekinenal浓度的增加，SMMC-7721 细胞凋亡率随之增加，呈明显的浓度依赖性。另外，我们发现与对照组相比，UL(坏死细胞)比例上升幅度并不明显，这说明pekinenal主要是对细胞的正常凋亡起作用，因此该药物可能能够减少临床应用上的一些副作用。流式细胞术分析发现, pekinenal作用后使SMMC-7721细胞S期比例增高，而G1和G2期细胞比例下降； 说明pekinenal抗肝癌的作用可能是通过抑制癌细胞DNA合成，将SMMC-7721细胞周期阻滞在S期而实现的。综上所述，本研究证明 pekinenal可使人肝癌 SMMC-7721细胞被阻滞于S期，抑制其增殖；通过诱导人肝癌细胞发生凋亡等，发挥其抗肝癌作用，为进一步研究该药的抗肿瘤机制提供了实验依据。

(致谢：本文实验在南京中医药大学基础医学院转化系统生物学与神经科学研究中心、中医脑病重点实验室以及江苏省中药资源产业化过程协同创新中心完成，均此致谢！)

参考文献:

[1]徐波, 朱光辉, 夏金堂, 李书华.中药癌痛克对人肝癌细胞 HepG2增殖、凋亡及 Rb 基因表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2007, 11(12):2253-6.

[1]Xu B，Zhu G H, Xia J T, Li S H. Influence of Chinese herb aitongke on the proliferation, apoptosis and Rb gene expression of hepatoma carcinoma cells HepG2[J].JClinRehabTissueEnginRes，2007，11(12):2253-6.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京: 中国医药科技出版社，2010 版，一部: 208.

[2]Chinese Pharmacopoeia Commission.PharmacopoeiaofthePeople’sRepublicofChina[S].Beijing: China Medical Science Press，2010，VolumeⅠ: 208.

[3]曹雨诞，陈海鹰，张丽，丁安伟. 醋制降低京大戟细胞毒性部位对小鼠肝脏氧化损伤机制研究[J].中国药理学通报，2014,30(2)：295-6.

[3]Cao Y D，Chen H Y，Zhang L，Ding A W. Vinegar processing attenuation the oxidative injury in mice livers caused by cytotoxic fraction of Euphorbia Pekinensis Radix[J].ChinPharmacolBul, 2014,30(2)：295-6.

[4]陈海鹰，曹雨诞，颜晓静，等.醋制降低京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性及机制研究[J].中国中药杂志，2013，38(6):866-70.

[4]Chen H Y，Cao Y D，Yan X J，et al. Study on detoxication and mechanism of vinegar-processed Euphorbia pekinensis on normal liver cells LO2[J].ChinJChinMatMed，2013，38 (6):866 -70.

[5]Tao W W,Duan J A,Tang Y P, et al. Casbane diterpenoids from the roots of Euphorbia pekinensis[J].Phytochemistry,94(2013) 249-53.

[6]李沐涵，王明艳，赵凤鸣, 等. 没食子酸诱导人肝癌细胞 SMMC-7721 凋亡机制的探讨[J]. 中国药理学通报，2014,30(5)：657-61.

[6]Li M H，Wang M Y，Zhao F M, et al. Study on gallic acid induced human hepatoma SMMC-7721 cells apoptosis and its mechanism[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(5)：657-61.

[7]韩丹，叶胜龙，刘彬彬，等.Survivin 在原发性肝细胞癌中的表达及其与侵袭、转移的关系[J]. 中华实验外科杂志，2007，24(12):1502-4.

[7]Han D, Ye S L, Liu B B, et al. Expression of Survivin in hepatocellular carcinoma and its relationship with the invasion and metastasis[J].ChinJExpSurg，2007，24(12):1502-4.

[8]Jia Z J, Ding Y L, Wang Q G, et al. Advance in the research of pharmacological Actfons of Euphorbiaceae[J].Phytochemistry, 1990,29(2): 343.

[9]Ei-Mokkawy S, Meselhy M R, Nakamura N, et al. 12-Oacetvlphorbol-13-decan-oate potently inhibitors cytopathic effects of hunman immunodeficiency virus type 1(HIV-1), with activation of protein kinese C[J].ChemPharmBull,1999,47(9):1346-7.

[10]刘桂芳,付玉琴,杨志强, 等 . 狼毒大戟抗癌活性成分二萜内酯的分离鉴定[J].中药通报,1988,13(5)：35-6.

[10]Liu G F, Fu Y Q, Yang Z Q, et al. Isolation and identification of antitumor constituents of diterpenoids lactone in Euphorbia fischeriana Saeud[J].ChinMedJ,1988,13(5)：35-6.

[11]张乐林，孙立立. 京大戟现代研究概述[J]. 中华中医药学刊，2011,29(3)：577-9.

[11]Zhang L L, Sun L L. Modern research of radix Euphorbia Pekinensis[J].ChinArchTraditChinMed，2011,29(3)：577-9.

JiangSuProvince,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Effects of diterpenoid pekinenal ofEuphorbiapekinensisRupr.on proliferation，cell cycle and apoptosis of hepatoma cells

CHEN Fei-yan1,TAO Wei-wei1,2,3, CHEN Kou-yu2,ZHANG Jia-qing2, WANG Yu-qing2, CHEN Gang2, DUAN Jin-ao3

(1.ResearchCenterofBasicMedicalCollege, 2.KeyLaboratoryofIntegrativeBiomedicineofBrainDiseases,SchoolofBasicBiomedicalScience, 3.CollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationof

Key words:EuphorbiapekinensisRupr;pekinenal; SMMC-7721；cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

Abstract:AimsTo study the effects of diterpenoid pekinenal ofEuphorbiapekinensisRupr. on cell proliferation, cell cycle phase and apoptosis of hepatoma SMMC-7721 cells and to probe into its anti-cancer mechanisms.MethodsMTT assay was used to investigate the effect of pekinenal on proliferation of SMMC-7721 cells; TUNEL method, Annexin V/PI staining and electron microscopy were employed to observe the cell apoptosis; Flow cytometry was applied to analyze the distribution of cell cycle.ResultsProliferation of SMMC-7721 cells was markedly inhibited by pekinenal in a dose-dependent manner; Annexin V/PI staining showed that with the increase of pekinenal concentration, apoptotic rate of SMMC-7721 cells increased significantly, compared with control group, the difference has significant statistical significance(P<0.01). TUNEL method test results showed that different concentrations of pekinenal in SMMC-7721 cells could induce liver cancer cell apoptotic and apoptotic index(AI) increased significantly (P<0.01) with the increase of drug concentration. Compared with control group, electron microscope found that after the treatment, hepatocyte mitochondrial swelling, endoplasmic reticulum expansion, cytoplasm inclusion body formation, part of the nucleus apoptosis, and the more obvious apoptosis appeared with the increase of drug concentration. Flow cytometry analysis showed that different concentrations of pekinenal could all make the cell block in S phase.ConclusionPekinenal has an obviously inhibitory effect on the human liver cancer cells, and there is significant concentration dependence; Pekinenal probably inhibits cancer cell DNA synthesis for the human liver cell cycle arrest in S phase and inhibits the proliferation . It plays a role in liver cancer inhibition by inducing liver cancer cells apoptosis, etc.

收稿日期:2015-12-18修回日期:2016-02-04

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No 2011CB505303);国家自然科学基金资助项目(No 81403041; 81274199);江苏省自然科学基金青年基金(No BK20140961)

作者简介:陈飞燕(1988-)，女， 硕士， 初级实验师，研究方向：中药抗肿瘤，Tel: 025-85811959, E-mail：feiyan88121@163.com; 陶伟伟(1984-)，男，博士，助理研究员，研究方向：中药药效物质基础，通讯作者,E-mail:tw845@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.016

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0519-05

中国图书分类号：R284.1；R329.24；R329.25；R329.28；R735.702.2

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.032.html