用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片构建及培养条件研究

徐为峰，王　帅,2,3，孟宪生,2,3，包永睿,2,3

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连　116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 沈阳　110032；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连　116600)



用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片构建及培养条件研究

徐为峰1，王帅1,2,3，孟宪生1,2,3，包永睿1,2,3

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 沈阳110032；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连116600)

摘要:目的设计制作用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，以海藻酸钙凝胶为细胞支架，基于芯片研究适合的凝胶形成、溶解条件，利用该条件长期培养SMMC-7721细胞并检测其活力。方法利用CDR软件、软光刻技术、模塑法、等离子键合法等设计并制作出微流控芯片并验证其适用性；在芯片中三维培养肝肿瘤细胞SMMC-7721，观察细胞形态，以IPP软件辅助计算细胞在72h的存活率。结果设计制作的微流控芯片适合于肿瘤细胞三维培养；芯片中培养的肝癌细胞72 h内生长状态良好，存活率达(96.1±4.5)%，细胞堆积排列紧密，出现肿瘤细胞聚集体(tumor cell spheroid, TCS)。结论该文设计构建用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，并用于肝癌细胞SMMC-7721培养，细胞生长状态良好，且细胞生长与聚集状态表现出一定特殊性。利用该芯片进行肿瘤细胞三维培养，可以为肿瘤细胞生长状态研究及抗肿瘤药物筛选提供更有利的方式。

关键词:微流控芯片；肿瘤细胞；肿瘤微环境；细胞三维培养；海藻酸钙凝胶；培养条件

微流控技术是兴起于近几十年的一项新技术，其应用于药理学研究最大的特点是可以在与人体微环境相似的条件下进行实验，且具有快速、灵敏、节约的优势[1-2]。二维细胞培养是目前使用较为普遍的一种细胞培养手段,亦广泛应用于体外肿瘤研究模型[3-5]。目前微流控芯片中的细胞实验多数是将PDMS芯片与玻璃层键合，将细胞在玻璃上平面培养，该方法利用了芯片微尺度研究及高效、节约的优势，但许多研究已经证明，平面培养状态下的细胞无法全面反映细胞在人体内的生长状态，Keiran等[6]研究发现，肿瘤细胞在二维与三维条件下RNA水平已出现数百个片段的差异。张旭朗等[7]通过构建体外微囊化肿瘤细胞三维模型研究发现，抗癌药物对微囊化乳腺癌细胞球的抑制率降低。刘劲松[8]的实验表明，三维培养的肝肿瘤细胞纤维蛋白骨架发生重排，结构与在体肝组织更接近。此外，三维培养下的细胞微环境、细胞间及细胞与基质间的相互作用能明显影响分泌、黏附、侵袭和转移等细胞功能[9]。因此，有必要将微流控技术与肿瘤细胞的三维培养结合，在更接近真实状态下进行实验研究。本实验设计了一种可以实现细胞三维培养的芯片结构，以大分子生物多糖海藻酸钠(C6H7NaO6)x和氯化钙形成的无毒、透明、生物相容性好、持水能力强的海藻酸钙凝胶为三维骨架[10-11]，对人肝癌细胞SMMC-7721进行长期培养。为基于微流控技术在细胞水平进行的肿瘤药理学研究提供了新的模式。

1材料与方法

1.1细胞悬液的制备人肝癌SMMC-7721细胞，购于昆明细胞库，以含小牛血清的RPMI 1640高糖培养基常规培养。当细胞在培养瓶中生长状态良好，密度大于80%时，以胰蛋白酶消化，培养液吹打，制成细胞密度为5×108·L-1的悬液备用。

1.2主要仪器与试剂匀胶机(KW-4A型，昆山力电精密机械有限公司)；光刻机(北京中科同志科技有限公司，TG-2U型)；体视显微镜(SMZ-745 ,尼康公司)；倒置荧光显微镜(ECLIPSE-TI，尼康公司)；等离子键合机(PDC-32G-2;HARRICK PLASMA公司)； LSP04-1A 精密注射泵(保定兰格公司)；酶标仪(SpectraMax384PLUS，美谷分子仪器公司)；图像处理软件Image-Pro Plus 6.0(IPP, 美国Media Cybernetics公司)。

海藻酸钠(Sigma公司，批号:081M1093V)；氯化钙(Sigma公司，批号：SLBC6574V)；柠檬酸钠(沈阳市试剂一厂)；荧光素钠(北京市化工厂，批号：101101，Mr：376.27)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI 1640培养基，胰蛋白酶(Gibco公司)；SU-8光刻胶及显影液(美国Micro-Chem公司，批号：33540H28)；Sylgard184 型聚二甲基硅氧烷(PDMS，美国DowCorning公司)。染色剂(LIVE/DIED® Viability/Cytotoxicity kit，美国Life-technology公司，批号1724759)

2微流控芯片的设计和制作

2.1芯片的结构设计该芯片由阀控层与细胞通道层组成，包含两组相互独立且相同的实验单元，见Fig 1。细胞通道层(图中蓝色)包括3条相同的细胞通道，每条通道由3个1.3 mm×1.5 mm的椭圆形微培养腔组成，上下两端为液体入口与出口；每条细胞通道两侧各有一条流体通道，流体通道通过若干个弧形微通道与微培养腔相连，其中，通过一侧与一条细胞通道相连的流体通道宽度为250 μm，通过两侧与两条细胞通道相连的流体通道宽度为500 μm，每条流体通道两端分别有液体入口与液体出口。流体通道在与连接微通道相连处变窄以保证流体压力均匀。每个细胞培养单元的阀控层(图中红色)位于微通道上方，为液压阀，依靠通入液体的压力导致薄膜形变压紧下方的微通道，整个微阀联动控制。

2.2芯片的制作芯片掩模打印于菲林片上。在高清洁度的硅片上旋涂SU-8光刻胶，高度约600 μm。按文献[12-13]制得芯片。将PDMS与洁净的玻璃片在等离子清洗机中以720 V, 25 mA, 18 W的参数处理3 min，取出贴合，以体积分数为0.75的乙醇和去离子水分别冲洗通道，烘干，即完成芯片的制作，见Fig 2。

2.3主要溶液的配制称取海藻酸钠(C6H7NaO6)x粉末，缓慢搅拌使海藻酸钠充分溶解，配制成质量浓度为10 g·L-1的溶液。分别称取不同质量的无水氯化钙(CaCl2)与柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2 H2O)，以三蒸水为溶剂，分别配制成质量浓度为10 g·L-1的氯化钙溶液和质量浓度为100 g·L-1的柠檬酸钠溶液。经0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存待用。

3芯片内成胶与溶胶效果考查

3.1芯片内成胶条件考查将含有质量分数为0.1 g·L-1荧光素钠的海藻酸钠溶液在“2.1”中的芯片微阀加压关闭的状态下，自各细胞注入口缓缓注入并充满微培养腔内，随后打开微阀，以玻璃堵头封住细胞培养通道两侧流体通道的排液口，自对应的进样口通入氯化钙溶液，使Ca2+经微通道渗入微培养腔内，作用15 min，与海藻酸钠发生交联反应生成海藻酸钙凝胶，于荧光显微镜下观察荧光分布是否均匀。

换将不含荧光素钠的不同浓度海藻酸钠溶液同上操作至“两侧流体通道的排液口”后，自流体入口通入含有0.1 g·L-1荧光素钠的氯化钙溶液，以同上方式生成凝胶。随后持续以培养液冲洗细胞腔两侧的微流体通道，除去多余的Ca2+，置倒置荧光显微镜下观察并拍照，结合图像分析软件IPP，分析微培养腔中凝胶胶体所含荧光素钠被培养液清洗的情况，判断海藻酸钙凝胶中的液体完成一次全更新的速度，即形成凝胶的通透性。通过微量注射泵，自两侧的液体入口向形成的海藻酸钙凝胶中持续通入培养液，在37℃，5% CO2中放置3 d以上，每日观察凝胶的性状。

3.2芯片内溶胶效果考查在微阀加压关闭的状态下，自与细胞腔相连的进样口向腔内持续以不同流速通入柠檬酸钠溶液，作用10 min，于细胞腔出口处收集流出液，镜下观察在规定时间内海藻酸钙凝胶完全溶解并自芯片内流出的效果。

3.3微流控三维细胞培养芯片中肝癌细胞生长状态的考查将“1.1”中密度为5×108·L-1的细胞悬液与等体积的海藻酸钠溶液均匀混合，使细胞密度为2.5×108·L-1。按照“3.1”中的条件及方法形成凝胶。由与培养腔相连的进液口向芯片细胞培养腔室中以0.1 mL·L-1的流速通入含体积分数为10% CS的RPMI 1640培养液长期培养。每日拍照观察细胞生长状态，比较增殖速度，记录3 d。3 d后以细胞活性检测试剂盒对细胞进行荧光染色，试剂盒由钙黄绿素-AM和乙锭二聚体-1组成。将钙黄绿素-AM 5 μL和乙锭二聚体-1 10 μL溶于PBS 1 mL中，混合均匀后自进液口通入到芯片中[14]，室温避光染色30 min后，使用荧光显微镜进行观察并拍照。细胞存活率按公式计算：细胞存活率/%=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%[15]。

4结果

4.1芯片适用性分析对芯片流体通道中流体的灌注以及液压微阀对通道的压紧效果进行了考察。结果显示，液阀未加压的时候，自流体通道注入的液体会均匀充满整个通道；液阀压紧流体通道与细胞通道间的微通道时，自流体通道入口注入的流体只经过流体通道而不进入细胞培养腔，而自细胞进样口注入的液体在充满微培养腔后由细胞通道的液体出口流出，不进入流体通道(Fig 3)。液阀灵敏度高，响应速度快，对流体通道压紧作用明显。

A: The micro-valve close the microchannel when pressure is given(40×);B: Liquids in the micro-chamber wouldn′t diffuse into the microchannel when pressure is given to the micro-valve(40×);C: Liquids in the micro-chamber diffuse into the microchannel when the pressure in micro-valve is removed(40×)

4.2芯片内成胶效果按筛选出的条件进行芯片内成胶实验，发现在实验条件下，利用该微流控芯片，10 g·L-1的海藻酸钠溶液pH在7.2～7.5之间。自该芯片上的流体通道注入10 g·L-1的氯化钙溶液，在规定流速下，Ca2+可均匀、缓慢渗入海藻酸钠溶液内部并与其生成凝胶，凝胶均匀充满腔体(Fig 4)，胶体含水量大，具有一定强度，具有较好通透性，在细胞培养条件下放置3 d保持稳定。

微培养腔内凝胶形成后，按照“3.1”所述，压紧微阀，自细胞注入口向微通道内以0.1 μL·min-1的流速通入培养液作用不同时间，置倒置荧光显微镜下观察胶体中荧光素钠被培养液清洗的情况，利用IPP软件分析荧光强度，结果显示，通入培养液60 s后，微培养腔内的荧光强度降低为初始强度的2%以下(Fig 5)。

4.3芯片内溶胶效果按照“3.2”中所述，自细胞培养腔入口以不同流速通入质量浓度为100 g·L-1的柠檬酸钠溶液10 min，结果发现，当流速过大时，柠檬酸钠溶液无法及时溶解海藻酸钙凝胶，造成芯片通道内压力过大；当流速过小时，海藻酸钙凝胶无法在10 min内被完全溶解。经筛选得到5 μL·min-1的流速下，10 min可将微培养腔内的凝胶完全溶解并全部自培养腔出口流出。

4.4芯片内肝癌细胞生长状态按照“3.3”中的方法培养细胞并染色拍照，结果发现，随着培养天数增加，培养腔内的细胞数量逐渐上升，以细胞活性检测试剂盒染色后发现细胞活力良好，见Fig 6；细胞形态呈类球形，偶见长梭型，常见多个细胞密集堆叠而成的肿瘤细胞球样聚集体，镜下发现细胞在腔内分布高度位置不同，见Fig 7。通过 IPP 软件辅助对细胞图像进行计数分析，培养3 d后细胞存活率为(96.1±4.5)%。

A: 24 h; B: 72 h(bright field);C: 72 h(fluorescence field)

5讨论

5.1芯片结构本实验设计制作了用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，选取具有良好生物相容性，无毒、透明、稳定的大分子生物多糖海藻酸钠与二价钙离子螯合生成的海藻酸钙作为骨架结构。在构建该芯片过程中发现，首要解决的问题是在微尺度液体层流状态下，Ca2+溶液如何均匀、缓慢与微培养腔中的海藻酸钠相接触，而不发生Ca2+溶液在与海藻酸钠接触后将海藻酸钠“推”出通道。为解决该问题，设计了Fig 1所示的芯片结构。Ca2+溶液由微培养腔两侧通道加压渗入微培养腔，与海藻酸钠螯合而成胶。海藻酸钠Ca2+形成凝胶后，会发生一定程度的皱缩，产生一定的空隙；此外海藻酸钙凝胶具有一定的强度，故可以自与细胞培养腔相连的入口以低流速灌注培养液进行动态培养。

5.2成胶、溶胶所需溶液应用方式在具体实验操作过程中，芯片中流体的切换难免涉及软管、接头的插拔，此外，即使迅速在保证无菌的条件下完成接头的更换，凝胶胶体中和芯片微通道内残留的Ca2+彻底排除也需要一定时间，本实验根据在使用流速下芯片内液体完成一次全更新的时间，提前更换连有培养液的接头。但此法仍然较为繁琐，今后拟设计一种无间断流体切换结构集成于芯片内从而解决该问题。另外该实验过程中不应引入含有能与Ca2+生成沉淀的阴离子，故PBS溶液在本实验中未使用，而以培养液代替。

5.3统计分析方法使用细胞活性检测试剂盒对细胞染色时，由于染色液需要渗入凝胶后着染细胞，因此孵育时间较常规染色略长，以30 min为宜。由于三维生长状态下细胞聚集成球，染色后计数分析准确度会受到干扰，本实验采用不同焦平面多次拍照，合并荧光图后计数的方式减小误差。但在本实验确定了应用该方法条件下细胞具有较高生存率之后，后续实验应尽量避免大量使用荧光染色后利用IPP软件计数的分析方法，而通过柠檬酸钠溶胶后使用如流式细胞术等更加准确快捷的方式。

6小结

肿瘤细胞微环境对于肿瘤细胞的发生、发展，肿瘤细胞的转移及其与外周环境的各种联系和物质交换均有重大的意义。但常规使用的细胞培养皿、多孔板均存在无法模拟肿瘤细胞生长的三维环境。通过与能够在微尺度下模拟体内生理状态的微流控芯片相结合，本文设计构建了用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，并筛选出适合的成胶、溶胶条件。在该条件下培养肝癌细胞SMMC-7721，细胞生长状态良好，且细胞生长与聚集形态与传统二维培养存在差异。利用该芯片和适合的三维培养条件，可以为在更接近真实人体的环境下深入研究肿瘤细胞特性，及抗肿瘤药物的筛选提供更有利的方式。

(致谢：本实验完成于辽宁中医药大学分析测试中心，感谢王达、索轶平、樊佳新等参与人员。)

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Microfluidic chip for tumor cell 3D culturing establishment and its cultural conditions

XU Wei-feng1, WANG Shuai1,2,3, MENG Xian-sheng1,2,3, BAO Yong-rui1,2,3

(1.CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning116600,China; 2.LiaoningMulti-ComponentsEngineeringTechnologyResearchCenterofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China;3.LiaoningModernizationResearchandEngineeringLaboratoryofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning116600,China)

Key words:microfluidic chip; tumor cell;tumor microenvironment;three-dimensional cell culture; sodium alginate; culture condition

Abstract:AimsTo design and fabricate the 3D cell cultural microfluidic chip for tumor cell culturing, with which to research the compatible conditions for gelatin forming and dissolving with calcium alginate as the scaffolds. To culture SMMC-7721 cells in the chip and to detect the surviving rate.MethodsThe microfluidic chip was fabricated with the software Corel Draw, the technology of soft lithography, molding, and plasma bonding. The applicability was tested and cells were cultured on it, on which the cell status was observed, their surviving rate was calculated with the help of the software IPP.ResultsThe chip we fabricate was calculated is suitable for cell 3D culturing, the tumor cells showed a favorable proliferation ability in 72 h on chip, the surviving rate was (96.1±4.5)%. The cells were solid and TCS appeared.ConclusionThe microfluidic chip manufactured appeared for tumor cell 3D culture, is suitable for the growth of SMMC-7721 and the cells are indubitable. They show some different status in proliferative and agminated compared with traditional 2D cell culture. With the chip and the condition found, there will be a better way to study the characteristics of tumor cells and is beneficial to the screen of anti-tumor drugs.

收稿日期:2015-12-26,修回日期:2016-02-18

基金项目：国家“十二五”重大新药创制专项(No 2013ZX09507005-005)

作者简介：徐为峰(1990-),男，硕士生，研究方向：药物分析,E-mail:xuwf0529@163.com; 孟宪生(1964-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析，通讯作者,E-mail:mxsvvv@126.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.027

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0581-05

中国图书分类号：R329.24；R34-33；R73-3；R735.7

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.054.html

◇实验方法学◇