应用冷光源内窥镜和点样吸头完成的新型小鼠气管滴注法

杨　彪，李新鸣，严思远，陈冬梅，牛佳钰，肖纯凌

(1. 辽宁中医药大学中西医结合基础学科，辽宁 沈阳　110032；2. 沈阳医学院环境污染与微生态重点实验室，辽宁 沈阳　110034)



应用冷光源内窥镜和点样吸头完成的新型小鼠气管滴注法

杨彪1，李新鸣2，严思远2，陈冬梅2，牛佳钰2，肖纯凌2

(1. 辽宁中医药大学中西医结合基础学科，辽宁 沈阳110032；2. 沈阳医学院环境污染与微生态重点实验室，辽宁 沈阳110034)

摘要：目的建立一套新型易操作的小鼠气管插管、滴注方法。方法依靠冷光源内窥镜和电泳点样吸头为插管工具，建立一套新型的插管操作系统。利用高倍放大，完成小鼠气管插管、滴注，研究中1周内对20只♂ CB17-SCID小鼠(体质量24～28 g)进行插管和滴注80 μL环境污染细颗粒物悬液。结果共完成80次插管、滴注操作，末次滴注24 h后解剖小鼠可见气管低端和肺内有散在的空气污染细颗粒物分布。结论应用冷光源内窥镜和电泳点样吸头进行的气管滴注新方法操作快速、简洁、可重复性好，能够广泛用于小鼠呼吸系统的插管和滴注操作。

关键词：气管滴注新方法；冷光源内窥镜；点样枪头；小鼠；实验技术；气管插管

随着呼吸系统相关疾病的深入研究，很多科研机构的实验室对小鼠气管滴注操作方法不断的进行革新，随之成功有效的技术手段得到广泛的应用。为了本课题组开展进一步科学研究的需要，我们建立了应用冷光源内窥镜直视技术进行小鼠气管滴注的新方法，这种方法的应用和推广将从经济和技术层面帮助到更多实验室的科研人员。本文简要描述具体的操作方法和要点，期待与广大研究者进行探讨和学习。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物20只清洁级♂ CB17-SCID小鼠[体质量24～28 g，许可证号：SCXK (京) 2012-0001]购于北京维通利华动物实验动物技术有限公司，常规饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物房内，12/12 h昼夜光照，动物房温度为22～24℃，湿度为70%。

1.1.2材料乙醚(国药集团化学试剂有限公司)、冷光源硬性内窥镜(外径2.7 mm, 徐州科能光电设备有限公司)、1～200 μL Pipette Tip (Thermo Fisher, Cat.# 010-Q)、2-20μL单通道移液器(Eppendorf, Germany)、空气污染细颗粒物悬液(实验室保留)、钝头镊子、50 mL离心管、棉球以及自行购置和设计的小鼠口腔撑开装置(1#手术线、铁架台)。如Fig 1所示。

1.2操作方法

1.2.1操作人员首先在50 mL离心管底部填充约10 mL左右空间的棉球，然后用加长巴氏吸管向棉球内部添加5 mL乙醚液体(大约能麻醉10只小鼠)，如果需要不断的增加小鼠麻醉数量，适时补充乙醚的使用剂量。对小鼠进行麻醉处理，观察小鼠的呼吸频率，待呼吸由急促转慢时，将其上牙挂置于固定于铁架台的手术线上面(Fig 2)，此时如果小鼠苏醒，重复进行麻醉。用钝头镊子将其舌部拉出固定，并将小鼠整个躯体固定，使口腔撑开便于另一操作人员完成气管插管的处理。

1.2.2操作人员一手持冷光源内窥镜，观察开闭的声门(Fig 3)，一手持移液器，待声门关闭前准确完成气管滴注过程，完成滴注过程的操作者要熟练冷光源内窥镜和插管工具点样吸头间的配合。完成上述操作内容平均每只动物需要2～3 min。

2结果

所有实验小鼠气管滴注均获得成功。滴注方法测试，将小鼠处死后，解剖可见气管下端至肺部位置均有黑色物质散在分布(Fig 4)，判定实验技术方法有效，气管滴注成功。

3讨论

随着近年各学科研究的飞速发展，进行呼吸道给药染毒操作的小鼠实验的需求呈上升趋势。但是由于小鼠口腔狭小，很难通过眼睛直视观察到声门，即气管的开口，所以对小鼠的气管插管操作很多研究者采用手术暴露颈部气管的方式，这种方法易操作，对实验动物造成的损伤大[1-3]。其他相关研究也对非手术方式小鼠气管滴注方法进行了介绍[4-8]，但操作方法都过于繁琐，或是用药的剂量无法进行准确的计算。

The arrows displayed fine particulate matters with successful instillation. A: The picture of lung tissue for tracheal instillation and performed with paraformaldehyde; B: The picture of instilled lung tissue on anatomic observation method

应用冷光源内窥镜和点样吸头完成的小鼠气管滴注法具有以下优点：① 电泳点样枪头的应用，对于操作者更加的简便，使插管操作灵活，可重复完成，同时对于小鼠更加的安全，电泳点样吸头有一定的韧性和弯曲性，并且前端较细一级吸头可以插入到支气管附近位置，是一个理想的小动物实验插管工具。② 冷光源直杆内窥镜所选择的冷光源不会烫伤小鼠的口腔和气管部位组织，避免了组织损伤所引起的一系列炎症反应，另外镜头可以将小鼠气管的声门放大3倍以上，便于操作者观察，从而更加顺利的完成插管实验。③ 如果是完成连续滴注实验，可以用戊巴比妥钠溶液进行麻醉，对小鼠口腔通过手术线挂牙的方式打开，进行点样吸头可视化插管；如果完成单次的气管滴注实验，用乙醚对小鼠麻醉，借助可视化移液器加样的方法进行气管滴注。

操作的注意事项：①控制麻醉的深度，当小鼠的呼吸频率由快到慢时，10 s后从麻醉容器中取出，进行下一步实验；②用镊子向外拉动舌头要适度，既要保证撑开口腔，又要避免损伤到小鼠；③滴注前，要对点样吸头插管深度进行解剖观测；④滴注时，由于操作空间较小，先放入点样吸头，再用冷光源内窥镜观察声门和吸头进行下一步操作；⑤为了保证实验的成功，还需进行滴注液体体积的测试，通常滴注液体为20～50 μL；⑥注意观察声门时不要使点样吸头接触到食管，以免产生气泡黏液，影响插管实验。

综上所述，采用实验室常用的点样吸头和一种冷光源内窥镜，大胆的改进和创新了实验操作的滴注方法，熟练此种技术只需经过数次初步的练习即可实施实验。可见，应用冷光源内窥镜和电泳点样吸头进行的气管滴注新方法操作快速、简洁，可重复性好，能够广泛用于小鼠呼吸系统的插管和滴注操作。

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A new method of mouse tracheal instillation with endoscope of cold light and gel loading tips

YANG Biao1, LI Xin-ming2, YAN Si-yuan2, CHEN Dong-mei2, NIU Jia-yu2, XIAO Chun-ling2

(1.BasicDisciplineofChineseandWesternIntegrative，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China;2.KeyLabofEnvironmentalPollutionandMicroecology,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Key words:new method of endotracheal instillation; endoscope of cold light; gel loading tips; mice; experimental techniques; endotracheal intubation

Abstract:AimTo develop a new method for easy endotracheal intubation and instillation in mice. MethodsRelying on the endoscope of cold light and gel loading tips, a new method was set up for intubated operations. Under high magnification, operations of endotracheal intubation and instillation were completed in mice. Twenty male CB17-SCID mice (between 24 and 28 g) were repeatedly intubated and instilled with 80 μL suspensions of air polluted fine particulate matters in a week. ResultsThe twenty mice were sacrificed after 24h of the last instillation. The dispersions of the air polluted fine particulate matters were found at the bottoms of tracheas and in both the left and right lungs in all mice. ConclusionUsing the endoscope of cold light and gel loading tips, a new method for tracheal instillation is set up in mice, which is rapid, simple and has good repeatability. It could be widely applied for the endotracheal intubation and instillation in mice.

收稿日期：2015-12-29，修回日期：2016-02-17

基金项目：沈阳市环境污染与重点实验室建设(No F14-181-1-00)；沈阳市科技局计划项目

作者简介：杨彪(1984- )，男，2014级博士生，研究方向：环境污染物对呼吸系统影响，Tel: 024-62215695, E-mail: y49781775@126.com； 肖纯凌(1964- )，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：大气污染对呼吸道的影响机制及微生态，通讯作者,Tel： 024-62215656, E-mail: xiaochunling@symc.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.028

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0585-03

中国图书分类号：R-332；R322.33；R332；R452；R472.9

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.056.html