促进前交叉韧带腱骨愈合的生物治疗技术研究进展

柴昉 蒋佳 陈世益

复旦大学运动医学中心，复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

促进前交叉韧带腱骨愈合的生物治疗技术研究进展

柴昉 蒋佳 陈世益

复旦大学运动医学中心，复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

前交叉韧带损伤为膝关节的常见损伤，采用软组织自体、异体或人工移植物重建前交叉韧带修复损伤日益增多。术后移植物与骨隧道愈合时间及愈合程度是影响手术疗效的关键因素。目前促进膝关节腱骨愈合的实验研究繁多，其中运用的生物治疗技术包括生长因子、干细胞、自体骨膜、富血小板血浆等，基因转染作为较新的治疗手段也有报道。包括基质金属蛋白酶组织抑制因子、雌激素在内的新型物质在基础实验中被证实有促腱骨愈合作用。现有生物治疗技术研究多为基础研究，大规模临床应用尚待时日。本文就促进膝关节腱骨愈合的生物治疗技术研究进展进行综述。

前交叉韧带；腱骨愈合；生长因子；雌激素

前交叉韧带（Anterior Cruciate Ligament，ACL）为膝关节的主要韧带支持结构，主要作用为限制膝关节过伸，防止胫骨过度前移、旋转，多于急停、急转变向时出现损伤[1]。美国前交叉韧带损伤的年发病率约为1/ 3000，每年病例数逾20万例，其中10～15万例需接受前交叉韧带重建手术以恢复正常结构和功能[2]。重建手术虽然恢复了ACL的解剖结构，但术后仍有0.7%～10%的病人会出现关节不稳乃至接受二次手术[3]，因为只有肌腱移植物与骨隧道牢固愈合才能获得良好的手术疗效[4]。以生长因子、骨膜移植、关节软骨移植等为主要治疗手段的生物治疗技术在骨科应用广泛，在包括骨缺损、骨折愈合、关节置换在内的多个领域均有相关研究文献报道[5-7]，其中部分生物治疗方式已应用于临床实践[8，9]。本文就采用生物治疗技术促进膝关节腱骨愈合的研究进行综述。

1 正常腱骨止点的解剖结构与重建术后腱骨界面的愈合方式

肌腱与骨结合部形态差异较大，根据生物力学不同可分为间接止点与直接止点两种类型。间接止点又称纤维止点，主要为致密纤维组织，以穿插连接移植肌腱与骨隧道并垂直于骨隧道纵轴的Sharpey胶原纤维为主要特征，多见于动物模型的术后愈合及长骨干附近腱骨结合部[10，11]。直接止点通过纤维软骨移行带连接肌腱与骨隧道，从韧带向止点方向依次为韧带、非钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨四层结构，在两类纤维软骨之间有“潮线”分隔，多见于正常ACL的腱骨止点或腱骨愈合晚期的骨隧道出口处[12-13]。直接止点可将力学负荷从软组织传导至骨骼上，在传导、缓冲应力的同时还可调控肌腱韧带的生长与胶原重塑[14]。

肌腱移植物在骨隧道中的愈合过程较为复杂，全过程包括隧道侧壁成骨、新生骨质再塑形、移植肌腱与止点界面血供形成、腱骨间出现Sharpey纤维、纤维软骨钙化等多个环节[15]。Hays等人发现大鼠前交叉韧带重建术后7天腱骨界面出现大量炎症细胞浸润，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor，FGF）等细胞因子大量分泌，界面表现为疤痕组织愈合[10]。术后10～14天腱骨界面处见新生骨小梁形成，纤维血管束增多并聚集于骨隧道壁上。术后28天腱骨界面纤维血管组织排布规则致密，逐步为软骨样细胞替代，此时腱骨间隙缩窄但胶原纤维排列仍不规则。术后42天肌腱移植物和骨隧道之间胶原纤维逐步成熟。术后56天腱骨界面出现Sharpey胶原纤维，为腱骨愈合的早期标志[16]。Shino等人以狗为实验对象研究腱骨愈合，发现形成典型的四层结构需时1年[17]。纤维软骨的再生作为腱骨界面的特征性结构对腱骨愈合起关键作用。

2 促进腱骨愈合的生物治疗技术

为促进ACL重建术后的腱骨愈合，获得在结构与功能上良好的腱骨界面，研究者采用了包括生长因子、干细胞、富血小板血浆在内的多种生物治疗技术。

2.1 生长因子

生长因子是一类可诱导有丝分裂、促进细胞分化成熟、促进新生血管形成的细胞因子。包括BMP、VEGF、FGF、转化生长因子（Transforming Growth Factor，TGF）-β、血小板类生长因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）在内的生长因子具有良好的骨诱导活性与调节骨形成能力[18]，于腱骨愈合过程中添加外源性生长因子可能会促进腱骨愈合。

BMP是一种广泛存在于骨基质的糖蛋白，可在皮下组织、肌肉等非骨骼系统中诱导软骨及骨的生长[19]，目前被认为是唯一具有异位成骨能力的生长因子[20]。Kim等将BMP-2注入兔ACL重建缝线锚钉处，术后4周、8周的组织切片显示实验组与对照组相比新骨形成明显，骨质成熟加快且腱骨界面处出现有序纤维软骨，生物力学失效载荷也优于对照组[21]。Schwarting等发现BMP-7可在小鼠细胞体外模型中促进成骨细胞、腱骨界面、成纤维细胞区域多种目标基因的表达，加速成骨细胞成骨与成纤维细胞的分化，加快腱骨愈合的进程[22]。

VEGF可特异性结合血管内皮细胞，诱导细胞分裂，促进新生血管形成[23]。Yoshikawa对30只日本白兔使用髌腱重建ACL，发现术后2～3周时腱骨愈合界面处VEGF高表达，随着时间推移移植物血管数量逐渐增加，VEGF也逐渐下降[24]。Yoshikawa还发现ACL重建早期移植物坏死区域扩大可造成血管再生触发机制缺失，VEGF分泌减少，移植物再血管化失败[25]。Takayama发现抑制VEGF表达可直接妨碍血管新生与移植物成熟度，使重建后ACL的生物力学强度弱于VEGF正常表达组[26]。上述研究均反映了VEGF对腱骨愈合促血管化过程的作用。

除BMP与VEGF外，FGF、PDGF等对腱骨愈合的影响也有报道。FGF根据等电点不同可分为酸性与碱性两类，其中碱性FGF（Basic FGF，BFGF）作为一种重要的体内创伤愈合因子能够促进骨、软骨和肌腱的组织修复[27，28]。Rui和Kaipel等研究发现PDGF可通过间接激活内皮细胞促进平滑肌细胞释放VEGF、FGF等生长因子，促进血管生成，加快骨与韧带愈合[29，30]。

生长因子促进腱骨愈合的研究虽日益增多，但大多数研究还处于临床前期阶段。主要原因包括生长因子价格昂贵，局部应用剂量难以确定，术中一次性使用之后因半衰期较短长期效果易受质疑，生长因子对下游信号通路网络的调节作用亟待明确等[31]。

2.2 基因治疗

因体内作用时间较短，交叉韧带重建部位局部使用生长因子多需单次大剂量或反复多次使用方可达到有效药物浓度。研究人员尝试通过转染携带有编码生长因子基因的载体改造活体细胞，使生长因子在被改造细胞中缓慢表达释放，在较长时间内维持有效生长因子浓度[32]。Dong等使用携带BMP-2基因的慢病毒转染骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，bMSC）获得稳定表达BMP-2的bMSC后，将之应用于新西兰兔ACL重建后腱骨界面处，组织切片显示BMP-2转染组在腱骨界面处有大量的软骨样细胞且垂直胶原纤维数量较对照组增加明显，生物力学测试发现BMP-2转染组在术后4周的最大载荷与术后8周的力学强度均较对照组为高[33]。Martinek等用携带BMP-2的腺病毒载体（AdBMP-2）转染半腱肌进行ACL重建，术后每隔2周行组织学检查，发现实验组腱骨间成骨活动增加伴大量软骨样骨质形成，对照组腱骨间见类Sharpey纤维，说明实验组腱骨愈合可能为直接止点愈合而对照组更倾向于间接止点愈合[34]。除病毒载体外，Shi等采用聚乳酸羟基乙酸纳米颗粒搭载BMP-4基因质粒，后者被成功转入脂肪干细胞并促进软骨形成，同时种植于聚乳酸羟基乙酸支架上的经BMP-4转染脂肪干细胞与对照组相比明显加快实验动物关节软骨形成速度[35]。

基因工程促进腱骨愈合可保证腱骨界面生长因子浓度持续稳定。囿于基因技术安全性与被转染细胞能否持续表达的考虑，目前转基因促进腱骨愈合尚处于基础实验阶段。

2.3 bMSC

bMSC具有自我复制与分化的能力，分布于全身结缔组织与器官，骨髓含量最为丰富[36]。Lim等在兔ACL重建模型中用与MSC复合的纤维蛋白胶质包裹肌腱移植物，术后14天组织切片腱骨连接处发现大量幼稚纤维软骨细胞，术后8周切片示类似直接止点的结构。生物力学测试发现与对照组相比干细胞组有更高的失效载荷与刚度[37]。Kanazawa等重建兔ACL后于肌腱移植物处加入自体bMSC，术后4周和8周组织学结果显示实验组腱骨界面处的活化软骨细胞较对照组为多且活性更强，实验组的组织切片于早期出现II型胶原免疫活性[38]。

干细胞的初步研究结果令人满意，但目前其处理过程包括获取骨髓细胞、细胞培养、分离纯化、细胞增殖等步骤，受试者等待时间长，且干细胞促进腱骨愈合的具体作用机制还不明了。

2.4 自体骨腰

研究表明骨膜包含诱导骨与软骨形成的间充质干细胞和成骨干细胞，部分学者认为在肌腱和骨骼之间的间隙填充骨膜有助于干细胞附着于腱骨界面以促进腱骨愈合[39]。现有临床实践中自体骨膜已被用于增强人体腱骨愈合[40]。Chang等在兔肩袖修复术中将自体骨膜缝于撕裂的冈下肌上，术后生物力学测试实验组与

对照组相比提升明显[41]。Chen等将胫骨近端骨膜缝合于趾长伸肌腱表面然后放入胫骨近端的骨隧道内。术后4周实验组新生骨组织与邻近骨组织交连，并可见纤维软骨连接。术后12周新骨已长入肌腱移植物内，生物力学测试发现实验组最大抗拔出力随术后时间延长增加且大于同期对照组[42]。上述实验说明包裹肌腱的骨膜对腱骨愈合存在促进作用，能防止滑液流入骨道，减少隧道扩大。

目前认为骨膜能促进腱骨愈合与骨膜内含有丰富的成骨干细胞有关，此外骨膜较多的生长因子及其促进新生血管形成的能力也能加速腱骨界面新生骨与纤维软骨的形成。更多有关骨膜在腱骨愈合中的作用机制尚待研究。

2.5 富血小板血浆（PRP）

富血小板血浆（Platelet Rich Plasma，PRP）是含超生理浓度血小板的全血衍生物。当血小板含有的α颗粒与血小板膜融合时，激活的血小板释放多种含量丰富的生长因子，促进损伤处细胞迁移分化[43]。PRP为腱骨界面提供富含多种细胞因子的局部微环境，避免单一生长因子的生理效应局限性。Xie等重建比格犬ACL时在实验组于腱骨界面应用PRP，术后2、6、12周PCR扩增发现VEGF、血小板反应蛋白-1等基因表达增高，推测PRP通过促进腱骨界面血管长入促进腱骨愈合[44，45]。Wu等在新西兰兔肩袖撕裂重建实验中于实验组加用PRP，术后6、12周组织学切片提示实验组较对照组腱骨界面愈合更为完全，新生肌腱纤维排列有序。术后6周实时PCR测定发现实验组较对照组BMP-2 mRNA高表达[46]。上述研究说明PRP可上调生长因子在腱骨愈合过程中的表达，提升腱骨界面强度，促进界面成熟。

PRP因含有较高浓度的生长因子且自体来源制备简单，被部分研究者与骨科医生认为在运动医学临床实践中具有广阔的应用前景[47]，Yuan等分析PRP的临床应用情况后提出目前PRP在肌腱韧带损伤治疗中的地位日趋上升，当前使用方法有一定改进空间[48]。Rodeo等完成的肩袖损伤随机对照实验结果显示PRP在腱骨愈合临床实践中无明显优势[49，50]，这可能与药物载体、个体差异、术后复建等因素有关。

2.6 其他生物治疗技术

随着研究的不断深入，以基质金属蛋白酶为代表的一系列物质被发现可能与腱骨愈合存在关联，雌激素等药物因其对骨相关细胞的调节作用亦被认为可纳入腱骨愈合的研究。

2.6.1 基质金属蛋白酶（MMP）组织抑制因子

基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）为一类可降解细胞外基质成分的锌离子依赖性酶。骨组织含多种基质金属蛋白酶，其中MMP-2主要由成骨细胞合成分泌，MMP-9主要由破骨细胞合成分泌，二者参与降解胶原、弹力蛋白等细胞外基质蛋白，其活性和创伤修复、组织发育以及移植物重构关系密切[51]。基质金属蛋白酶组织抑制因子（Tissue Inhibitors of MMP，TIMP）作为MMP的内源性抑制剂与MMP共同作用，参与调控细胞外基质的动态稳定性[52]。Wang等发现外源性MMP-2能显著提高离体培养ACL成纤维细胞愈合能力，这一作用可能与下游NF-κB信号通路有关[53]。Akesen等研究了ACL重建病人手术前后关节穿刺液中TIMP浓度，发现与术前相比术后TIMP浓度上升明显，提示TIMP可能与重建术后腱骨界面愈合有关[54]。Demirag等采用同侧半腱肌重建新西兰兔ACL，术中实验组关节处注入TIMP，术后关节液内MMP含量、病理切片胶原纤维含量、生理力学测试等结果实验组均优于对照组，进一步说明TIMP可促进腱骨愈合[55]。

MMP种类较多，对应抑制因子TIMP数量也较为丰富，针对性筛选对腱骨愈合有重要影响的MMP和相应的TIMP将成为未来研究热点。

2.6.2 雌激素

雌激素主要由卵巢和肾上腺皮质分泌，作用于生殖系统、骨骼、脂肪等组织，其效应主要通过雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）介导。ER可分为ERα与ERβ两个亚型，其中ERα与骨组织中雌激素效应关系密切。ER存在于成骨细胞、破骨细胞和骨细胞中，以雌二醇为代表的雌激素通过作用于上述细胞或刺激细胞分泌调节生长因子直接或间接地影响骨质的形成与吸收[56]。Yoshida提出雌激素可能会改变ACL近端韧带组织的组分[57]，Liu等发现ACL上存在雌激素靶细胞，提示雌激素可能对ACL的组织结构与生理功能存在调节作用[58]。雌激素在性成熟期女性中因存在周期波动被认为是女性ACL断裂的一项相关因素[59]，但Seneviratne将绵羊ACL成纤维细胞置于不同浓度雌激素下培养发现各组间成纤维细胞的增殖与胶原合成能力差异无统计学意义，提示ACL损伤与雌激素波动之间关联性尚待阐明[60]。另一方面雌激素通过BMP、VEGF、IGF-1等生长因子参与成骨细胞分化、成熟与凋亡抑制等环节，促进新生血管形成和骨质形成，加快腱骨愈合。Matsumoto等发现雌激素可通过上调BMP-4促进成骨细胞分化[61]。Windahl和Kondoh等先后发现骨细胞中ERα经Wnt信号通路调节对骨小梁形成有促进作用[62，63]。Oliver等发现行双侧卵巢切除术进行雌激素缺乏相关性骨质疏松造模的实验组大鼠在股骨骨折后骨折愈合缓慢，双能X线骨密度测量、影像学及生物力学结果均显示雌激素缺乏组骨折处愈合不佳，功能减退[64]。与之相对，Spiro发现选择性雌激素受体调节

剂雷洛昔芬可促进股骨骨折小鼠骨折愈合[65]。腱骨愈合作为与骨愈合有相似机制的修复重建过程，我们认为雌激素具有促进腱骨愈合的可能性。

相较于生长因子、骨膜包裹肌腱移植物、骨髓干细胞等材料，雌激素具有药物价格适中、操作简便易行等优点，同时局部使用雌激素可避免全身应用导致的副作用[66]。

3 结语

膝关节前交叉韧带重建手术术后腱骨愈合情况是影响手术效果的重要因素，使用生物治疗技术可加快促进腱骨界面的有效愈合。细胞因子可促进腱骨界面纤维软骨与骨质的形成，干细胞、自体骨膜、富血小板血浆等方法对细胞因子的表达存在刺激与加强作用，基质金属蛋白酶组织抑制因子与雌激素作为较为新颖的生物治疗方法也存在研究前景[67]。如前所述，目前大多数生物治疗方法还停留于基础研究阶段，用于临床实践的目前仅有自体骨膜与PRP，此二者制备操作相对简单，收费适中，临床效果较确切。这提示生物治疗技术在从实验室至临床应用的转化过程中除需具有促进腱骨愈合作用外，还需考虑大规模临床使用的可操作性与简便性，同时病人对生物治疗技术相对高昂价格的承受能力也应纳入考量。对生物治疗技术的的进一步研究有助于前交叉韧带重建病人术后疗效提高与功能改善。

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2015.10.28

国家高技术研究发展计划（863计划：2015AA033703）；国家自然科学基金（81271958，81572108，81370052）

陈世益，Email：cshiyi888@163.com