孢子丝菌复合体的分子生物学研究进展

贺　羽，赵秘密，杨致邦，周　汛，3



孢子丝菌复合体的分子生物学研究进展

贺羽1，赵秘密1，杨致邦2，周汛1，3

孢子丝菌是人兽共患性真菌，感染人或动物可引起孢子丝菌病。以往形态学鉴定认为申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii，S.schenckii)为孢子丝菌病的唯一致病菌种，而近年来分子生物学研究发现该菌是6个菌种构成的复合体，并且在基因鉴定、基因组学、发病机制等方面有了进一步研究，有利于理解孢子丝菌病的发生发展过程，对于早期诊断、确定治疗方案及判断预后至关重要。本文就孢子丝菌复合体的分子生物学研究进展进行综述。

孢子丝菌；基因鉴定；基因组；发病机制；分子生物学

孢子丝菌是人兽共患性真菌，感染人或动物可引起皮肤、皮下组织及附近淋巴系统的慢性肉芽肿性病变，偶可经血液、淋巴系统播散引起系统性损害[1]，严重时可危及生命。孢子丝菌由美国人Shenk首次发现，故被命名为申克孢子丝菌[2]。以往形态学鉴定认为申克孢子丝菌为孢子丝菌病的唯一致病菌种，而近年来分子生物学研究发现该菌是多个菌种构成的复合体[3]。生物信息学的发展让我们对孢子丝菌有了更多更新的认识，本文就近年来孢子丝菌复合体在基因鉴定、基因组学、发病机制方面的分子生物学研究进展进行综述。

1　基因鉴定

1.1基因分型孢子丝菌的基因分型通常基于mtDNA限制性内切酶HaeⅢ的限制性片段长度多态性(RFLP)分析，Lin等首次将不同地区S.schenckii菌株的mtDNA分成24种亚型，而后25到30种，以及31到32种亚型被相继发现[4]，并将32种亚型划分为A、B 2个系统发育组，不同亚型其地理分布存在差异。研究者采用ITS-RELP分析将rDNA分为4个亚型[5]，其中Ⅰ-Ⅲ型与A组一致，Ⅳ型与 B组一致。张振颖等采用RFLP 技术和Southern印迹法进行rDNA基因分型发现我国不同地区31株临床孢子丝菌显示出15种不同的DNA带型(A-O)，51.6%DNA模带为A-C型，南方和北方菌株存在明显差异，但不能明确基因型与临床型别间的关系[6]。张萍等采用多聚酶链反应随机扩增多态性DNA法研究发现新疆申克孢子丝菌显示出新基因型，与北京固定型孢子丝菌病致病菌存在种内基因差异，而与北京、哈尔滨淋巴型孢子丝菌致病菌间未见种内基因差异[7]。

1.2菌种鉴定及基因诊断通过保守序列包括CAL、ITS及β-tubulin基因变异分析发现孢子丝菌复合体包含6个菌种，包括巴西孢子丝菌(Sporothrixbrasiliensis，S.brasiliensis)、球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa，S.globosa)、申克孢子丝菌等[3, 8-9]，菌种不同其毒力、地理分布、药物敏感性等存在差异。分子生物学技术的发展为准确而快速鉴定菌种提供了新方法，对于早期明确致病菌种类型以指导治疗具有重要意义。利用通用引物T38的PCR指纹图谱分析发现各隐含种显示出不同电泳条带，与利用CAL基因分析鉴定菌种的结果一致[10]。Rodrigues等运用CAL基因的PCR-RFLP分析实现了对孢子丝菌复合体各隐含种的基因鉴定[11]，认为该方法准确、简单且成本低，可用于常规的菌种分类。Oliveira等首次将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱术(MALDI-TOF-MS)用于鉴定孢子丝菌各隐含种，并指出通过蛋白质谱分析可准确、快速鉴定6个菌种[12]。近期滚环扩增技术(RCA)被用于孢子丝菌不同菌种间的鉴定，研究表明其特异性和敏感性均较高[13]。孙田等利用聚合酶链反应-酶联免疫法(PCR-ELISA)筛选与孢子丝菌结合效率相对较高的探针，结果显示探针U26852、U26866、U26866、M85053及AF117945均位于PCR扩增产物序列上，而U26852显色最强，EI 值最高，由此推断探针U26852的结合效率相对较高[14]。

2　基因组学

2.1结构基因组学Tateishi等对8株日本临床S.schenckii进行染色体核型分析显示S.schenckii基因组全长约28 Mbp，包含6～8条染色体，每条长度为460到6 200 kb，而Torres-Guerrero对不同地理来源菌株进行研究发现其基因组全长约45 Mbp[15]，这种差异可能由实验菌株为不同隐含种或研究方法不同引起。近期Teixeira等通过比较基因组学研究发现S.schenckii和S.brasiliensis在基因组长度、转座子、线粒体基因等方面存在差异[16]。前者基因组含17条染色体，全长32.3 Mb，后者含20条染色体，全长33.2 Mb；转座子分别由0.34%和0.62%基因组构成；线粒体基因组比较显示编码归巢核酸内切酶的内含子只存在于巴西孢子丝菌。而双向基因组对比显示两者染色体序列相似性高达97.5%；基因组进化分析发现两个隐含种均大约在3.8～4.9万年前开始分化，推断为最近的一次物种形成事件；两者基因组中与植物腐烂相关的多糖裂解酶基因缺乏表明孢子丝菌从植物致病性向动物致病性的进化演变。

2.2功能基因组学袁立燕等利用BLASTx等生物学软件对S.schenckii的cDNA中编号为Locus-168-Contig-1的序列进行分析发现该基因与亚精胺合成酶基因同源，全长1 062 bp，可编码291个氨基酸；编码蛋白疏水性高，为非分泌型蛋白，无质体、线粒体等定位序列及跨膜螺旋结构；并成功克隆全长编码区基因和构建重组表达质粒[17]。采用同样方法翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的cDNA全长序列被获得，其结构及功能、潜在抗原表位被预测出，为进一步研究该蛋白生物学特性奠定了基础[18]。通过RNA干扰技术将孢子丝菌钙/钙调蛋白激酶1基因表达抑制后菌株在35 ℃环境下生长抑制表明该基因与菌株耐热性相关；通过基因敲入，可表达绿色荧光蛋白(GFP)的孢子丝菌已成功构建，为研究孢子丝菌蛋白质组学和基因组学提供了新技术[19]。Rodriguez-Caban等通过RAN干扰和酵母双杂交技术明确了HSP90与钙/钙调蛋白激酶1在孢子丝菌双相转换中的相互作用[20]。王晓慧等通过简并PCR结合RACE技术成功克隆S.schenckii的未知过氧化氢酶基因并将其命名为Sscat，为深入研究该基因结构及其功能、蛋白质表达奠定了基础[21]。

3　发病机制

孢子丝菌病的发病机制与病原体毒力和宿主免疫状态密切相关。毒力和宿主免疫状态的分子生物学研究能够揭示疾病的发生发展过程，为孢子丝菌病治疗提供新靶点。

3.1病原体毒力孢子丝菌毒力主要与色素、黏附力及耐过氧化物能力等相关。孢子丝菌菌丝相和酵母相均可生成色素，包括1,8二羟基萘黑色素、真黑色素、脓褐素。研究发现分生孢子的黑化作用能够抵抗吞噬细胞的吞噬[22]，此外Madrid等分别用黑化和白化孢子丝菌感染小鼠发现前者仅在接种部位形成肉芽肿样皮损，而后者形成多病灶性皮损，因此推断色素可能与病原体播散相关[23]。孢子丝菌粘附素通过与纤连蛋白、层粘连蛋白和Ⅱ型胶原蛋白结合粘附宿主，两个生长时相均可表达粘附素，但酵母相粘附细胞外基质的能力更强[24]。Ruiz-Baca等首次通过二维凝胶电泳和免疫印迹法对S.schenckii的免疫原性蛋白进行检测发现70 kDa糖蛋白(Gp70)是2个生长时相均存在的主要细胞壁抗原[25]，而Gp60主要存在于酵母相[26]。研究显示Gp70是重要的粘附素，参与病原体入侵宿主的过程。转化生长因子β1可增加内皮下细胞外基质的暴露诱导孢子丝菌黏附内皮单层而经内皮迁移，在免疫功能受损患者中易致播散型孢子丝菌病[27]。近期研究发现S.brasiliensis的耐过氧化物能力较S.schenckii更强[28]，计算机模拟分析推断这种差异可能与氧化应激信号通路中类似AP-1的转录因子差异表达和Hog1基因突变有关。致病性相关蛋白的研究目前甚少，机体感染孢子丝菌6周后，孢子丝菌细胞壁的糖肽复合物能够抑制宿主免疫反应，被认为与真菌致病性相关[19]；从S.schenckii酵母相提取抗原过程中可水解人IgG的分泌蛋白被发现，该蛋白可能参与孢子丝菌抗宿主的免疫反应[29]。3.2宿主免疫状态病原体入侵后机体迅速作出防御反应，包括固有免疫和特异性免疫，后者分为细胞免疫和体液免疫。补体系统可被孢子丝菌激活，特别是替代途径激活后形成的膜攻击复合物可溶解破坏真菌细胞壁[16]。研究发现酵母相细胞壁模式识别受体Toll样受体4(TLR4)即CD284可促进促炎性细胞因子释放和氧化物质如NO的生成[30]；Negrini等通过构建感染孢子丝菌的TLR2缺陷小鼠进行研究发现巨噬细胞吞噬功能受损，并且促炎性细胞因子分泌水平明显降低[31]，可见TLRs在孢子丝菌固有免疫中扮演着重要角色[30-32]。参与细胞免疫的细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等。Uenotsuchi等运用流式细胞技术分析发现分离自皮肤的S.schenckii可快速激活单核细胞来源的树突状细胞(MoDCs)引起Th1细胞分泌大量IFN-γ参与反应，而分离自内脏的S.schenckii仅激活少量MoDCs和Th1细胞，有丝分裂原激活蛋白激酶P38和c-Jun氨基末端激酶信号通路被认为参与该反应过程[33]。研究发现孢子丝菌分生孢子可激活肥大细胞释放大量TNF-α和IL-6，而复合物48/80可诱导加强分生孢子刺激肥大细胞释放组胺，此外该细胞的功能消耗能够显著降低皮损程度[34]。Kajiwara等用孢子丝菌感染NADPH氧化酶和抗氧化酶缺陷的肉芽肿样疾病(chronic granulomatous disease，CGD)小鼠进行研究发现CGD小鼠不能清除接种部位真菌导致系统播散而死亡，由此可见NADPH氧化酶缺乏可致孢子丝菌致命性的感染，同时免疫细胞产生的超氧阴离子及其代谢产物如活性氧、活性氮在抑制和杀灭真菌中起着重要作用[35-36]。感染孢子丝菌5到6周后，Th2细胞产生IL-4启动机体体液免疫，体外实验中抗神经鞘糖脂类抗原的抗体可阻碍孢子丝菌的生长及分化[37]。Nascimento等研究发现感染孢子丝菌的小鼠可产生抗Gp70的特异性IgG3和IgG1抗体，可能与机体清除病原体有关[38]，而近期研究认为被动免疫抗Gp70的抗体可保护小鼠免遭孢子丝菌感染[39]。

4　结　语

近年来随着分子生物学的发展，对孢子丝菌有了更深入认识。生物学技术的运用在基因层面上实现了对孢子丝菌的菌种鉴定，但因技术要求较高，仅限于实验室研究，探索临床快速鉴定菌种和早期诊断疾病的方法仍是目前研究热点。孢子丝菌基因组DNA由30万左右个碱基组成，确定各部位结构及功能已经成为未来研究方向和目标。同时明确发病机制，寻找新靶点在治疗及预后判断方面有重要指导意义。

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Advances on molecular biology ofSporothrixcomplex

HE Yu1, ZHAO Mi-mi1, YANG Zhi-bang2, ZHOU Xun1,3

(1.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.ExperimentalTeachingCenterforBasicMedicalPathogenBiologyandImmunologyLaboratoryofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.DepartmentofDermatologyandCosmetology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China)

Sporotrichosis is a polymorphic disease that affects both humans and animals worldwide caused by the fungal genusSporothrix. Sporotrichosis has been attributed to one single etiological agent,Sporothrixschencki, by morphological identification in the past decades. Recently, isolates received asSporothrixschenckiare regrouped with six cryptic species, and further research on molecular biology study on gene identification, genome and pathogenesis is helpful to understand the development and progression of Sporotrichosis, and has important significance on early diagnosis, treatment and prognosis. The present review will focus on recent advances on molecular biology ofSporothrixcomplex.

Sporothrix; gene identification; genome; pathogenesis; molecular biology

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31270062)

Zhou Xun, Email: zhouxun123@sina.com

周汛，Email：zhouxun123@sina.com

1.重庆医科大学附属第一医院皮肤科，重庆400016；2.重庆医科大学基础医学院基础医学实验教学中心病原生物学与免疫学实验室，重庆400016；3.重庆市中医院皮肤美容科，重庆400021

R379

A

1002-2694(2016)06-0576-05

2015-12-04；

2016-02-15

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.013

国家自然科学基金(No.31270062)资助