简析病理学的常用技术原理及实施要点

赵振刚 吕 莉（吉林市人民医院病理科，吉林 吉林 132001）



简析病理学的常用技术原理及实施要点

赵振刚 吕 莉
（吉林市人民医院病理科，吉林 吉林 132001）

【摘要】病理学为一门活跃，但又古老的学科，在医学领域、生物学领域，占据着重要的作用。其中在医学教育中，病理学这是临床检验以及疾病诊断的重要手段，在医学中起着不可替代的作用。分析研究病理学常用技术原理，并分析其应用实施情况。

【关键词】病理学；技术原理；实施要点

病理学为一门基础性医学课程，其主要涉及的内容为研究人体疾病发生原因、发病机制、发展规律、疾病机体中形态、功能代谢以及病变转归。一直以来，病理学被看作临床医学与基础医学之间的桥梁学科。客观分析病理学常用技术以及实施情况，对于之后临床医学诊疗水平的提高有重要作用。

1　人体以及组织与细胞病理学技术

1.1 基本观察：主要借助放大镜或单纯靠肉眼、磅秤以及量尺等工具，细致剖检人体标本病变的大小、颜色、质地、表面以及周围组织器官，并进行统计测量、取材，若有必要可摄影留作检查资料。观察人体大体，是病理医师的基本工作内容，也是正确诊断的第一步，为医学生学习病理的主要方法。

1.2 观察组织病理学：经肉眼已经确定的病变组织取材后，采用石蜡包埋或福尔马林溶液固定制成切片后，在不同方法染色后经光学显微镜观察，分析、综合其病变特点，诊断病理。组织切片最常用的染色方法是苏木素-伊红染色。这一方法为研究以及诊断疾病最常用、最简单的方法，若不能做出明确诊断，可辅助采用免疫组化、特殊染色以及其他观察方法。

1.3 观察细胞病理学：取样病变处细胞，经涂片染色后进行诊断、观察。一般来说，细胞的来源主要为女性生殖道、食管、口腔、鼻咽喉等病变部位处直接取脱落细胞，也可是自然的排泄物、体液、分泌物中的细胞。细胞学检查不仅可用于患者，同时还可用于普查肿瘤。检查设备简单、操作方便，对患者造成的疼痛轻微，容易被患者所接受。但若需确诊是否为恶性病变，需实施活检确诊。

2　免疫组织化学技术以及组织化学

2.1 免疫组化以及免疫细胞化学：免疫组化以及免疫细胞化学是是由传统的组织化学以及免疫学结合而形成，是利用抗原体特殊性结合反应进行检测的一种技术。免疫组化技术具有较高的特异性以及敏感性，同时还能改变形态学，与功能、代谢变化相结合，直接可在细胞涂片、组织切片或培养细胞爬片上，确定某些多肽类物质存在，并具有较高的精确性，可定量分析被检测物质。

2.2 组织化学：一般可称为特殊染色，通过应用某些可于细胞或组织的化学成分发生特异性结合的显色试剂，定位显示病变，且能保存原有组织形态，实现代谢与形态的结合。

3　电子显微镜技术

电子显微镜技术神经电子透镜以及电子术合成的电子光学系统多极放大后，微小物体被放大成像，提高分辨率。其中透射电子显微镜为应用最早、最广泛的一种电镜。光学显微镜以及电子显微镜的基本原理相同，不同时电镜的照明源为电子术，光镜的照明源为可见光。因电镜的分辨率较高，因此电镜样本的处理以及超薄切片涉及，要比光镜技术更为复杂以及精细，但基本过程相同，包括组织取材、固定、浸透、包埋等。电镜样本制备不同于常规病理制备，它要求组织必须新鲜，选择最具代表性的区域小块取材；双重组织固定；环氧树脂包埋；重金属盐染色；半薄切片染色后组织定位实施切制超薄切片。

4　显微切割技术

显微切割技术为当前临床新兴的一门技术，它可从细胞涂片任意区域、或组织切片切割下几十个、几百个同类细胞。用显微切割组织切片是采用石蜡包埋组织切片、细胞切片、冷冻切。其厚度为4～10 µm，且冷冻切片需经乙醇固定。另外，显微切割的组织切片必须染色，便于进行单一细胞或目标细胞定位。染色方法不固定，也可采用免疫组化染色。常用的显微切割方法为手术操作方法、激光捕获显微切割法。显微切割术的特点是从构成复杂的组织中，获得某一特定的单个细胞或同类细胞群，比较适用于肿瘤分子生物学研究。但该技术的不足在于操作难度大。

5　核酸原位杂交技术

原位杂交是核酸分子杂交一部分，将分子生物技术与组织化学相结合用于检测以及定位核酸的技术。它是将已经标记好的核苷酸片段作为探针，经杂交直接在细胞涂片、培养细胞爬片或组织切片上定位以及检测某一特定靶的RNA或DNA的存在。其生物化学基础为碱基、复性、DNA变性互补配对结合，依据所选取的探针以及待检测靶序列不同，有RNA-RNA杂交、DNA-RNA杂交、DNA-DNA杂交。

5.1 选择并标记探针：适用于原位杂交的探针有单链cRNA探针、单链cDNA探针、双链cDNA探针以及合成的寡核苷酸探针。一般探针标志物有非放射性、放射性之分，前者有生物素、地高辛、荧光素，尽管其敏感性不佳，但性能稳定、操作简单方便、成本低，被越来越广泛应用于临床治疗中，后者敏感性较高，但有放射性污染以及半衰期，耗时长所需费用高，因此应用受到限制。

5.2 原位杂交程序：所需的材料为冷冻组织切片、常规石蜡包埋组织切片、细胞涂片、培养细胞爬片等，主主要程度为杂交前准备、预准备、杂交、杂交后处理、杂交体检测等。操作中应该注意：对RNARNA杂交、DNA-RNA杂交，需先采取RNA酶灭活处理；杂交温度不能低于杂交体解链温度25 ℃。

5.3 荧光原位杂交：可直接或间接实施荧光原位杂交，直接发是讲荧光素直接标记到已知的DNA探针，检测靶序列为DNA；间接法：非荧光标志物为已知DNA探针，并与一个荧光标记抗体桥连。

6　激光扫描共聚焦显微技术

激光扫描聚焦显微镜（LSCM）为当前生物医学图像分析仪器研究中药成果之一，是利用计算机图像、激光扫描技术、光学显微技术结合而形成的高技术设备，主要组成部位有计算机、显微镜、扫描头以及激光器。共聚焦成像利用探测点以及照明点共轭特性，抑制同一聚焦平面上非测量点杂散荧光，其获得的分辨率显著高于显微镜。同时具有纵向分辨率以及深度识别能力，可清晰看到较厚生物样本细节。

6.1 LSCM主要功能：细胞、组织光学切片，利用计算机以及图像的处理系统对亚细胞结构、组织进行分层扫描，可称为显微CT或细胞CT；重建三维立体空间；长时间观察活细胞；定量测定细胞内的酸碱度、细胞离子；荧光漂白恢复技术，利用高强度的脉冲式激光照射某一区域处，会该区域的荧光分子进行漂白；研究细胞间通讯。

6.2 LSCM样本要求以及使用局限：LSCM中要求的样本最好为培养细胞样本，石蜡包埋切片则不适用于该技术。LSCM主要采用直接或间接的荧光原位杂交技术以及免疫荧光染色技术。其中的抗体的质量或荧光标记的探针会对实验结果起到直接的影响作用。

7　原位多聚酶链式反应技术

原位多聚酶链式反应技术（PCR）为多聚酶链式反应技术，是在体外经酶促反应高效、快速扩张某一特定DNA序列，可将单一拷贝的待测核酸以指数形式增加，而达到常规检测水平，不能实施组织定位。原位PCR技术是将原位杂交细胞与细胞学定位相结合，在细胞涂片、石蜡包埋组织切片或培养细胞上爬片上检测，定位核酸［1-3］。

原位PCR技术可用于检测以及定位低拷贝内源性基因，在完整细胞样本上，可检出单一拷贝DNA序列，可用于研究观察基因重排、基因突变，还用于检测以及定位外源性基因［4-6］。随着当前现代生物技术的不断进步发展。理论上讲，PCR为一种完美的技术，其敏感性较高，具有基因细胞内定位功能，但该技术应用尚不完善。主要表现为特异性不高；技术操作复杂；需结合采用特殊设备，应用器械价格昂贵。

随着自然科学的不断进步发展，医学逐渐形成多种分支，其共同目的在于从不同角度，采用不同方法研究患病机体的生命活动，病理学从形态学、病因学等、生物化学等方面进行研究分析，保证人们的生命健康。

参考文献

［1］ 胡永波.分子病理学技术应用原理和适用范围［J］.中国伤残医学，2013，21（10）:464-465.

［2］ 董建强，田玉旺.病理技术学科的规范化与质量控制［J］.诊断病理学杂志，2013，20（12）:737-739.

［3］ 王文勇，黄晓峰，闫庆国，等.新技术、新方法在病理学中的应用［J］.临床与试验病理学杂志，2012，28（8）:909-911.

［4］ 刘刚，赵德军，白浪.失眠病因病理及非药物治疗［J］.中国疗养医学，2014，23（3）:282-282.

［5］ 段英飞，赵小军，李晓锋，等.病理信息系统在病理技术工作中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2014，30（3）:334-335.

［6］ 邹万忠.重视病理学的研究和应用［J］.北京大学学报:医学版，2008，40（4）:341-342.

中图分类号：R36

文献标识码：C

文章编号：1671-8194（2016）08-0298-02