绵羊绿脓杆菌分离鉴定及药物敏感性试验

王凤璐（山东省临沂市河东区畜牧兽医局 276000）

绵羊绿脓杆菌分离鉴定及药物敏感性试验

王凤璐（山东省临沂市河东区畜牧兽医局 276000）

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

临沂市河东区某绵羊饲养场，饲养500余只两月龄左右的绵山羊突然发病死亡。病羊以咳嗽，呼吸困难，流脓性鼻液，部分羊腹泻。以急性死亡为主，2d之内死亡12只。发病率高达20%，死亡率在16%以上。病死羊腹部膨大，剖检可见肝脏肿大质脆，有局灶性灰白色纤维素性膜，肺水肿，内有泡沫，尖叶、心叶肉变，间质增宽；脾肿大，包膜增厚；胆囊肿大，胆汁稀薄；肾包膜增厚，有的发黄，有出血点；肠系膜浑浊，肠系膜淋巴结肿胀呈索状，切面灰白色，小肠内有稀薄的黄绿色内容物；气管喉头充血，内有泡沫样黏液；有的皮下有胶冻样渗出物；膀胱内有黄色尿液：腹股沟淋巴结水肿。

1.1.2 培养基及试剂

普通营养琼脂（购自青岛高科园海博技术有限公司）、肉汤培养液（购自北京奥博星生物技术有限公司）、SS琼脂培养基（购自北京中海生物科技有限公司）、麦康凯琼脂培养基（购自北京陆桥生物科技有限公司）、三糖铁培养基（购自购自北京陆桥生物科技有限公司）、细菌生化常规微量鉴定管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）等。

1.1.3 药敏试验纸片

药敏试纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.1.4 试验动物

20g左右的小白鼠10只，由兽医预防医学实验室提供。

1.2 试验仪器

SW-WJ-LCU洁净工作台（苏州安泰空气技术公司制造，编号A20100107）、FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司制造，出厂号55201，型号FA2004N）、生化培养箱（北京泰克仪器有限公司制造，型号LRH-250A）、立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号YXQ-LS-SU）。

2 试验方法

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 各种培养基的制备

普通琼脂培养基、肉汤培养液、SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁培养基按常规进行配制，4℃保存备用。

半固体培养基：在制备普通肉汤培养基的基础上再加入0.3～0.5%的琼脂粉混合加热融化，分装灭菌，趁热竖立放置，待凝固后，4℃保存备用。

血液培养基：将普通琼脂培养基加热融化高压灭菌后，待冷至55℃左右加入无菌的脱纤家兔鲜血5%混合后，倾注于灭菌平皿。待凝固后放入37℃恒温箱内培养24h，无细菌生长的血液平板4℃保存备用[1]。

2.1.2 涂片及染色

无菌操作取病死绵羊的肝脏、心血、肾脏和渗出物及分离培养物涂片，干燥，革兰氏染色，镜检。

2.1.3 分离培养与观察

无菌操作取病料肝脏、心血分别接种于普通肉汤培养基、普通琼脂平板培养基、血液琼脂平板培养基、SS培养基、三糖铁培养基、麦康凯培养基上，置37℃恒温箱中培养24h，观察其生长变化情况。

2.1.4 运动性观察

用灭菌的接种针取液体肉汤培养物穿刺半固体培养基，置37℃恒温箱中培养24h，观察其生长情况。

2.1.5 生化试验

用灭菌的接种针取液体肉汤培养物接种细菌生化常规微量鉴定管，置37℃恒温箱中培养24h，观察其生长发酵情况。

2.2 动物致病性试验

将以分离菌接种于营养肉汤37℃培养24h，应用平板稀释法计数含菌量，使其达到8×108cfu/ml。将小鼠分成2组，每组5只，试验组腹腔注射0.5ml菌液，对照组腹腔注射0.5ml无菌生理盐水。隔离饲养1周，记录小鼠发病率和病死率，剖检死亡小鼠，观察病变并分离细菌。

2.3 药敏试验

采用纸片平板扩散法（K-B法），取纯培养物，无菌接种于营养肉汤培养基中，培养16～18h得到幼龄菌液。取幼龄菌液0.1ml于普通营养琼脂平板表面，用“T”形涂布棒涂匀，待其稍干后，用无菌镊子将药敏试纸均匀等距贴在培养基表面，置37℃恒温培养箱中，培养18～24h，观察并记录抑菌圈的直径，以抑菌圈直径大小作为判定细菌对药物敏感性的标准。

判定标准：抑菌直径＜10mm为耐药；抑菌直径10～15 mm为中度敏感；抑菌直径＞15 mm为高敏[2]。

3 试验结果及分析

3.1 涂片染色结果

取培养物涂片固定，经革兰氏染色后观察，可在显微镜下看到中等大小革兰氏阴性的小杆菌，多单个存在、少部分成对存在，未发现芽胞和无荚膜。该形态特征与绿脓杆菌的形态特征相同。

3.2 分离培养结果

病料接种37℃培养24h观察。结果该菌在普通培养基生长出光滑、湿润、微隆起、边缘整齐的中等大小的菌落，该培养均能产生水溶性的绿色素和荧光素，使培养基呈蓝绿色；血液培养基上菌落周围有透明的溶血环，说明该分离菌具有溶血作用；分离菌在肉汤培养基中呈混浊生长。上部液面呈蓝绿色，表面有白色菌膜形成；在SS琼脂上也生长良好，培养72h后有的菌落中央呈绿棕色；在麦康凯培养基上生长良好，呈白色菌落，培养基呈暗色；三糖铁培养基培养24h，试管底部不出现黄色，说明该分离菌不能产生硫化氢。以上培养特性与绿脓杆菌的培养特性相同。

3.3 运动性观察结果

在穿刺的半固体培养基中呈放射状生长，培养基上层呈绿色，说明该分离菌具有鞭毛，能运动，能产生水溶性的绿色素。

3.4 生化试验结果

本菌能分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇。尿素水解缓慢，不产生硫化氢和吲哚。能还原硝酸盐，V-P试验和M.R试验均为阴性。以上结果与绿脓杆菌的生化试验结果相同。

3.5 动物致病性试验结果

小鼠后接种分离菌于10～20h内全部死亡，接种小鼠死亡前均出现精神沉郁，身体抖动。对照组观察7d未见异常。剖检死亡小鼠可见肝、脾、肺、肾脏明显肿大；脾脏严重充血，肝脏有出血点，肾脏出血；肺脏充血，皮下有胶冻样淡绿色渗出液，并能从死亡的小鼠脏器中分离到接种菌。

3.6 药敏试验结果

分离菌株对盐酸左旋氧氟沙星、乳酸环丙沙星高敏，对卡那霉素、丁胺卡那霉素、硫酸铵普霉素、头孢噻呋钠、多黏菌素、青霉素、链霉素等药物产生了耐药。

4 讨论

（1）通过该病的流行病学、临床症状、病理剖检变化以及实验室诊断结果综合分析，该羊场本次疾病的发生和流行是由于绿脓杆菌感染引起。

（2）根据药敏试验结果，对全场发病羊饮0.5%盐酸左旋氧氟沙星，连饮3d。全场搞好卫生，用百胜30消毒，每日1次。同时饲喂营养丰富的料，该病4d得到了有效的控制。

（3）绿脓杆菌是一种条件性致病菌，对畜禽的致病力不强，未能引起人们的足够重视。但是近年来，有关绿脓杆菌导致的畜禽疫病日渐增多，应引起重视[3]。

（4）从药敏试验结果可以看出，绿脓杆菌对大多数药物产生了耐药性，因此在临床治疗该病时应尽量做药敏试验，根据药敏试验的结果选择有效药物，以免延误治疗时机。

（5）该病预防主要是加强饲养管理。给予营养丰富的优质饲料，禁止饲喂霉败变质和被病原微生物污染的饲料，注重环境卫生，定期消毒。

[1]姚火春.兽医微生物学实验指导（第二版）[M].中国农业出版社,2011:19～21.

[2]韩青松,简永利,涂宜强,等.绿脓杆菌研究进展[J].畜牧与饲料科学,2012,33（1）:122-124

[3]周学章,田东林,邓明旭.雏鸡绿脓杆菌病病原菌的分离和鉴定[J].中兽医医药杂志,2004（3）:19-21.