4-1BBL在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义

王笑朵 韩雪松

（1 沈阳和平永嘉口腔门诊部，辽宁 沈阳110000；2 辽宁省武警总队医院口腔科，辽宁 沈阳 110034）

4-1BBL在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义

王笑朵1韩雪松2*

（1 沈阳和平永嘉口腔门诊部，辽宁 沈阳110000；2 辽宁省武警总队医院口腔科，辽宁 沈阳 110034）

目的 分析口腔鳞癌组织中4-1BBL（4-1BB Ligand，即4-1BB配体）的表达水平以及临床意义。方法 应用PCR、FQ-PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）以及免疫组化法检测我院口腔肿瘤科获取的63份口腔鳞癌组织标本和35份癌旁正常口腔组织中4-1BBL的表达水平，对比不同组织中4-1BBL表达的差异，分析4-1BBL表达的临床意义。结果 口腔鳞癌组织中4-1BBL mRNA和蛋白的表达量显著高于正常组织，不同分化程度的鳞癌组织4-1BBL表达程度具有显著差异，高分化癌组织中4-1BBL表达水平最高，低分化组织中4-1BBL表达最少，P＜0.05，差异具有显著性。结论 口腔鳞癌组织中4-1BBL表达水平显著升高，且4-1BBL表达与癌组织分化程度具有密切关联，分化程度越高，4-1BBL表达量越高。

口腔鳞癌；4-1BBL；临床意义

口腔鳞癌作为口腔癌常见类型，不仅能够破坏颜面美观性，而且能够造成严重功能障碍，具有较高的病死率。随着基因组学的发展，基因对于肿瘤的影响受到了广泛关注，目前相关研究[1-2]证实共刺激分子4-1BBL具有抗肿瘤活性，对于癌症的免疫治疗效果、预后情况能够产生重要影响。本文通过分析比较不同组织组织中4-1BBL表达的差异性，旨在分析4-1BBL对于口腔鳞癌诊治的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象：选取辽宁省武警总队医院2010年4月至2015年6月在手术治疗中留取的21份口腔鳞癌组织和19份癌旁正常组织作为实验检测标本，口腔鳞癌中女性患者11例，男性患者10例，年龄29～71岁，平均年龄（53.46±4.19）岁，其中高分化者8例，中分化者7例，低分化6例，所有患者在手术治疗切取癌组织的同时留取癌旁正常组织，所有患者均在知情同意的基础上接受治疗和参与实验。病理选择标准：①经病理检查证实为口腔鳞癌；②年龄＞18岁；③排除合并其他口腔疾病者；④排除转移癌、合并全身严重基础疾病者；⑤能够耐受手术治疗，相关标本留存完好。

1.2 实验材料：口腔鳞癌组织、癌旁正常组织（我院病理科提供）；PCR和FQ-PCR试剂盒、Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒以及人4-1BB/4-1BBL（Invitrogen公司）；CPR 4-1BB引物（上海生工生物公司）；荧光定量分析仪（美国R＆D公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 标本保存：将所留标本分为2份，其中一份用于RNA提取，保存在液氮之中，另一份用于免疫组化检测，用多聚甲醛固定、石蜡包埋后在4 ℃下保存。

1.3.2 检测方法：通过Trizol对口腔鳞癌组织和正常组织进行总RNA提取之后，添加Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录获得总DNA，采取PCR、FQ-PCR电泳检测4-1BBL的表达水平，FQ-PCR反应体系为10 μL，在添加体系中加cDNA（1 μL）之后，参照试剂盒说明书所列步骤进行检测，其反应条件为：95 ℃下进行5 min→94 ℃下进行30 s→58 ℃下进行30 s→72 ℃下进行30 s，共完成40个循环。在本实验中所涉及的4-1BBL和β-actin内参照均采取FQPCR扩增处理，组间表达差异的计算公式为：2－△Ct（△Ct）=Ct4-1BBLCtβ-actin），得到2－△Ct（△Ct）统一进行分析。免疫组化结果根据阳性百分数（0～4分，分数越高，阳性细胞越多）和染色强度（0～3分，分数越高，染色强度越高）进行计分，总分为0～1者为阴性，2～3为弱阳性，4～5为阳性，6～7为强阳性，其中不低于3分者均归于4-1BBL表达阳性范围。

1.4 统计学处理：数据分析用SPSS16.0统计学软件，计量资料用t检验分析，计数资料用卡方检验分析，P＜0.05，差异具有显著性。

2 结 果

经过检测分析后，4-1BBL在正常组织和鳞癌组织中均可见阳性表达，但是其在鳞癌组织中的表达水平明显高于正常组织，利用FQPCR进行定量分析，将正常组织中4-1BBL的表达量作为标准，经过计算发现鳞癌组织中表达量约为其的2.20倍，进一步对不同分化程度的鳞癌细胞进行比较，结果发现低分化者的4-1BBL表达量最低，将其作为标准，中分化者约为低分化的1.52倍，高分化者约为低分化者的2.33倍，经过统计学分析，P＜0.05，差异具有显著性。免疫组化结果显示，正常组织中共有染色结果11例为阳性，阳性率为31.42%，鳞癌组织共有48例为阳性，阳性率为76.19%，其中36例高分化者有29例为阳性，阳性率为80.56%，16例中分化者有9例为阳性，阳性率为56.25%，13例低分化者有3例为阳性，阳性率为23.08%，经过统计学分析，P＜0.05，差异具有显著性。

3 讨 论

4-1BBL作为肿瘤坏死因子超家族的一员[3]，能够通过配体-受体的方式进行信号传导，其能够维持T细胞活性，目前相关研究证实具有延长免疫应答、增强抗肿瘤效果的作用[4-6]。4-1BBL能够通过调节细胞毒性T细胞增殖参与肿瘤，目前相关研究发现4-1BBL在多种肿瘤中均有所表达，并且其能够通过调节T细胞等细胞免疫因子活性而参与抗肿瘤效应发生过程。目前有研究发现，在肿瘤组织中4-1BBL表达水平显著升高，其能够增加细胞毒性，产生抗肿瘤治疗的作用，而在在人口腔鳞癌组织中，4-1BBL表达水平显著升高，其能够提高宿主抑制肿瘤进一步增殖，因此，对4-1BBL肿瘤的发生发展具有重要作用。随着基因组学的发展，4-1BBL在肿瘤诊治中意义的研究也越来越多[7]，但是针对口腔鳞癌与4-1BBL相关性的研究则是凤毛麟角。本实验结果显示4-1BBL在正常组织和口腔鳞癌组织中均可表达，其中鳞癌组织的表达水平显著高于正常组织，而对于不同分化程度的鳞癌组织进行分析显示，分化程度越高，4-1BBL的表达水平越高，表明4-1BBL表达量与癌组织分化程度具有显著相关性。综上所述，4-1BBL在口腔鳞癌组呈高表达，其表达水平与分化程度显著相关，有望成为判断口腔鳞癌分化程度的参考指标。

[1] 姜文国,张树平,董秀红,等.4-1 BBL在淋巴瘤组织中的表达及其临床意义[J].实用癌症杂志,2014,29(3):249-251.

[2] Kuang Y,Zhang L,Weng X,et al.Combination Immunotherapy with 4-1BBL and CTLA-4 Blockade for the Treatment of Prostate Cancer [J].Clin Develop Immunol,2012,2012,27(2):158-163.

[3] Jianhui M,Bo-Ram B,Jiawei L,et al.The TNF family member 4-1BBL sustains inflammation by interacting with TLR signaling components during late-phase activation[J].Sci Signaling,2013,6 (295):1749.

[4] 孙顺涛,杨宏宇,罗娟,等.4-1BBL在人口腔鳞癌PBL-SCID鼠嵌合模型肿瘤免疫中的作用[J].中国口腔颌面外科杂志,2012,10 (5):354-358.

[5] 黄敬东,孟玉生,林玉婷,等.4-1BBL在口腔鳞癌中的表达及临床意义[J].口腔医学研究,2015,31(6):609-612.

[6] Bo Ram Bang †,Sang Jick Kim †,Yagita H,et al.Inhibition of 4-1BBL-regulated TLR response in macrophages ameliorates endotoxin-induced sepsis in mice.[J].Eur J Immunol,2015,45(3): 886-892.

[7] 匡幼林,翁小东,刘修恒,等.重组腺病毒介导前列腺特异性膜抗原基因和4-1BBL基因修饰的树突状细胞疫苗体外诱导抗肿瘤免疫作用[J].中华实验外科杂志,2012,29(12):2376-2380.

*通讯作者：E-mail:yjckwxd@126.com