奶牛隐性乳房炎诊断技术研究进展

马金梅，迟　良，邹　明，刘焕奇

（1.青岛农业大学，山东青岛　266109；2.栖霞市动物卫生监督所，山东栖霞　265300）

奶牛隐性乳房炎诊断技术研究进展

马金梅1，2，迟良1，邹明1，刘焕奇1

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.栖霞市动物卫生监督所，山东栖霞265300）

目前，奶牛隐性乳房炎已成为奶牛常见的多发病，给奶牛养殖业带来了严重危害和巨大经济损失。本文对当前该病的主要诊断技术与方法，包括体细胞计数法、乳汁PH检验法、乳汁电导率检测法、乳汁细菌培养、PCR检测方法、MTT检测法等，进行了对比阐述，以期为选择和研究奶牛隐性乳房炎相关诊断方法提供借鉴。

奶牛隐性乳房炎；诊断技术；细胞计数法；乳汁PH检验法；乳汁电导率检测法；乳汁细菌培养；PCR检测方法；MTT检测法

奶牛隐性乳房炎是奶牛的一种常见性、多发性疾病，具有发病率高、传染性强、危害性大等特点，可直接造成产乳量减少、牛乳废弃、牛乳价值降低等后果。奶牛隐性乳房炎无明显的临床症状，常被养殖户忽视，导致治疗不及时进而发展成临床型乳房炎，给奶牛养殖业造成了严重危害和经济损失。由于奶牛隐性乳房炎无明显临床症状，对该病的诊断需借助实验室诊断技术，目前主要诊断方法有以下几种。

1　体细胞计数法

体细胞计数（SCC）是指计算每毫升乳汁中含有的体细胞数量［1］。乳汁中的体细胞主要包括乳腺分泌组织中的上皮细胞和炎性刺激产生的白细胞。当奶牛患乳腺炎后，白细胞数量增多，加之部分上皮细胞受损脱落，从而使体细胞数量增多。因此，根据乳汁中体细胞数的变化来判断奶牛是否患有乳房炎，是诊断奶牛隐性乳房炎的一种较为简便、可靠的办法。常用的方法有体细胞直接计数法和间接计数法。

1.1 体细胞直接计数法

一般采用专门的荧光显微自动测定仪来检测。Little和Plas-trige发明了直接显微镜计数法（DMSCC），认为每毫升乳汁体细胞数超过50万即可认为是乳房炎［2］，但目前对此结果的判定有所争议。

1.2 体细胞间接计数法

1.2.1 加州乳房炎测试法（CMT）。其原理是牛奶中的体细胞在氢氧化钠、烷基芳基磺酸等表面活性物质和碱性药物作用下，乳中体细胞被破坏，释放出DNA进一步作用，使乳汁产生沉淀或形成凝胶。体细胞数越多，产生的沉淀或凝胶就越多，可由此间接诊断炎症的程度。这种方法是国际通用的隐性乳房炎诊断方法。由此原理还衍生了很多类似的检测方法，如美国的威斯康星乳腺炎检测法（WMT）、日本的PL法、北京的BMT法等。其特点是操作简单、快速、敏感，环境温度对其影响小，适用于大范围推广，不足之处在于它只是体细胞的相对数量，判断结果的准确性需依靠检测者的经验而定，有时会出现假阳性。

1.2.2 DNA含量测定法。此方法依据的原理是牛奶中的体细胞被破坏后，其释放的DNA含量与体细胞数呈正比，Urbanova等［3］通过研究证实了这一点。然后采用分光光度计测定得到DNA的量，转化成体细胞数。DNA含量测定法比CMT、WMT具有更高的精度，然而，由于DNA分离太过繁琐，且DNA的精确含量本身就带有很大的误差，难以在奶场或牛奶加工现场大规模应用。

1.2.3 ATP法。作用机理是体细胞内的ATP在荧光素酶的作用下，与荧光素结合产生的荧光和ATP浓度成正比，因此可以通过测定荧光的强度来测定ATP的浓度，从而间接测定牛奶中体细胞数。

1.2.4 黏度法。作用原理是利用活性试剂促使体细胞释放出的DNA和组蛋白跟牛奶形成胶状混合物质，从而使牛奶黏度增加。体细胞越多，则释放的DNA越多，牛奶的黏度也越高，通过黏度值可测算其体细胞数。由于此方法对样品的前期处理比较繁琐，不利于现场应用，一般在实验室操作。

1.2.5 红外热成像法（IRT）。红外热成像技术是一项前途广阔的高新技术。严建军等［4］在牛奶体细胞数检测的研究进展中提到，受感染的奶牛乳房表面温度与牛奶体细胞数存在着一定的正相关关系，因此可以估算出牛奶体细胞数，从而检测是否患有乳房炎。此方法对隐性乳房炎的检测准确度较高，但所检测的表面温度与体细胞数的正相关性一般以估算为主，存在误差。

1.2.6 介电常数法（REP）。作用机理是当体细胞处于低频电场时不容易被极化，体细胞的相对介电常数低，但在某种特定频率电场下易被极化，相对介电常数会明显增大。Grillo等［5］通过两年的研究，发现了在特定的条件下（即温度为10～34 ℃、电压为100 mV、电场频率为300 kHz）相对介电常数与体细胞数之间存在的正相关性，基于此来检测乳房炎的结果要比电导率检测法稍准确。

2　乳汁PH检验法

正常牛乳汁的PH值通常在6.5～6.8之间。当奶牛发生乳腺炎时，毛细血管的渗透性增加，偏碱性的血液成分进入到乳汁中，从而导致牛奶的PH值增加。与体细胞间接计数法相比，PH法是一种定性方法，对于识别隐性乳房炎具有较好的敏感性且操作简单。

3　乳汁电导率检测法

从20世纪40年代开始，人们就开始研究利用隐性乳房炎乳汁导电性增强的原理来检测隐性乳房炎，但真正走向实用化是在20世纪80年代。

乳汁电导率检测法的作用机理是，在正常情况下，牛血浆与牛奶的渗透压相等，大约有75%由氯化钠和乳糖形成。当发生乳房炎时，乳腺上皮组织细胞制造乳糖能力下降，牛奶的渗透压就低于血浆渗透压，形成了血管壁与乳腺细胞之间渗透压差，使Na+、Cl¯、HCO3¯等离子渗透到牛奶中，引起电导率的增加。电导率与体细胞数之间存在正相关性［6-8］，但此相关系数只有0.503 6，因此电导率检测法存在很大误差［9］。

电导率检测法（CDM）与PH检测法的原理相似，都是检测乳汁中导电离子的浓度，只是电导率检测法检测的是多种离子的浓度，而PH检测法只是检测H+的浓度。

4　乳汁的细菌培养

以上三种方法可用于初步诊断奶牛隐性乳房炎，但进一步确诊需要进行病原微生物的分离与鉴定。对乳汁中的细菌进行培养，根据染色形态特征选择性地进行3%氢氧化钾试验、接触酶试验、凝固酶试验、CAMP试验等鉴定致病菌。细菌培养操作繁琐且工作量大，存在许多局限性，如患有隐性乳房炎的乳汁中体细胞数高，影响细菌的生长，易产生假阴性结果。

5　PCR检测方法

Phuektes等［10］、Riffon等［11］以16S～23S rDNA间隔区为扩增靶序列，建立了多重PCR检测方法。该方法能够快速鉴定奶牛乳房炎的病原菌。武守艳等［12］同样选择了16S～23S rDNA区间，针对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌设计了3对特异性引物，并通过优化退火温度、引物浓度等扩增条件，以及研究病原菌PCR扩增的特异性和敏感性，确立了对这3种病原菌特异、敏感、快速的PCR鉴定和检测方法，为PCR法在奶牛乳房炎的诊断方面奠定了基础。通过该方法，无乳链球菌的灵敏性为104cfu/mL，金黄色葡萄球菌灵敏性为105cfu/mL，大肠杆菌灵敏性为103cfu/mL。肖颖等［13］也通过多重PCR方法设计了多对引物，针对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致病性酵母菌及无乳链球菌等进行检测，对隐性乳房炎的检出率达82.5%.

PCR技术的应用弥补了细菌学培养的不足，尤其是在建立了多重PCR方法后，在病原菌的诊断上既节省了试剂的用量，又缩短了检测时间［14］。

6　MTT检测法

MTT是一种黄色的可接受氢离子的染料，能被活菌细胞内线粒体膜上的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色的不溶性的甲臜类物质，沉积在细胞中。而死细胞中无琥珀酸脱氢酶，则不会出现此现象。甲臜类物质可以在含50%的N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜（DMSO）中溶解，然后用酶联免疫检测仪在540 nm或720 nm波长处测定其OD值，以此间接反映活细胞数量。伊岚等［15］通过实验将MTT法用于奶牛乳房炎的药敏试验，有效、准确、快速、筛选出了抗菌药物，但由于甲臜类物质需被溶解后才能检测，大大增加了工作量。

7　其他诊断方法

7.1 乳成分直接检测法

对乳成分的变化进行直接检测与分析，可以提高对隐性乳房炎的预测能力及奶牛的患病程度的诊断。

7.2 酶类检测法

正常牛奶中10%～20%的NAGase由白细胞提供，剩下的均来自乳腺组织。当奶牛患有乳房炎时，乳腺组织被破坏，NAGase释放增加。另外，奶牛患有炎症时白细胞释放的NAGase也增加，乳中NAGase的活性显著增加，Middleton研究证实了这一结论。因此，该方法可以准确、可靠地判断乳汁是否为乳房炎乳，但此检测法工作量大，且仪器造价高。

7.3 生物芯片或微控检测方法

崔传金等［16］将生物芯片或微控检测法应用到奶牛乳房炎的检测上，尤其是利用细胞的电容效应、阻抗测试等，设计不同结构的微传感器或生物芯片来降低背景噪声，极有可能解决细胞含量的检测问题。这种检测方法的优点是传感器制作成本低、检测精度高且可现场检测，适用于基层奶牛养殖户及大型牛场。

8　小结

以上所述的对奶牛隐性乳房炎的诊断方法，大多都只是建立在实验室基础上的，而不太适合基层奶牛养殖场。目前养殖场使用最多的还是乳汁体细胞计数法，而不论是直接体细胞计数法还是间接体细胞计数法都存在一定的优缺点。直接体细胞计数法检测准确性高，但其检测过程较为繁琐，工作量大，自动化程度高，检测设备费用高，适用于小样本的精确检测，不便于大范围推广，其应用主要局限在大型的检验中心和经济实力雄厚的大型奶厂和牛奶加工企业。间接体细胞计数法大多通过检测牛奶体细胞所具备的不同物理、化学特性值，并通过它们与体细胞数量之间的关系对体细胞数进行估算，可以快速检测出奶牛是否患病，但对病症严重的程度诊断能力有限，且检测的精度不高，容易出现误诊。

因此完善乳汁体细胞计数法，研究一种操作简便、准确有效且适用于从散养户到任何规模牛场的检测手段，是业内人士研究的重点。例如，相关材料曾记载的被毛微量元素检测法，利用检测人、动物毛发微量元素来诊断各种疾病。该方法的国内外相关报道有很多，但牛毛中微量元素与隐性乳房炎关系的报道很少见。如果能研究出一种经济、简便且有效的“牛毛诊断隐性乳房炎”的方法，相信会得以广泛应用。

总之，随着技术的不断发展创新，对奶牛隐性乳房炎的诊断方法越来越多、越来越优化，因此，必须选取最有效、最实惠、最适合养殖场的诊断方法，从而使奶牛养殖业健康、稳定的发展。

［1］ 郭小萍，刘宜勇，扎依达·夏木西丁，等. 乳房炎的研究进展及防控措施［J］. 中国畜禽种业，2015（11）：64-66.

［2］ Little R B. Mastitis［M］.New York and London：W.NBorine，1946.

［3］ Urbanova E，Seinova V，Skarda J，et al. Use of The Synpor Membranc Filter for The Separation and Determination of The Number of Somatic Cells in The Milk of Dairy Cows Usin The Indole DNA Filtration Method［J］.Yet Med，1985，30（7）：409-418.

［4］ 严建军.牛奶体细胞数检测的研究进展［J］.计算机测量与控制，2016，24（2）：5-10.

［5］ Grillo G J，Perez M A，Anton J C，et al. Direct-evaluation of the fresh-milk somatic cell concentration through electrical permittivity measurements，Proceedings of the 19th IEEE conference on Instrumentation and Measurement Technology［J］. 2002（1）：153-157.

［6］ Norberg E，Hogeveen H，Korsgaard I R，et al. Electrical conductivity of milk：ability to predict mastitis status［J］. Journal of dary science，2004，87（4）：1099-1107.［7］ 郭庆，王鲁，朱伟，等. 牛乳电导率值与体细胞数相关性的研究［J］.贵州畜牧兽医，2009，33（5）：1-3.［8］ 方海田，刘慧燕. 牛乳乳汁电导率变化与体细胞数相关关系的研究［J］.现代食品科技，2007，23（4）：86-88.

［9］ 康平.牛奶体细胞快速检测方法的研究［D］.杭州：浙江大学，2006.

［10］ Phuektes P，Mansell P D，Browning G F. Multiplex polymerase chain rection assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and strepiococcal causes of bovine mastitis［J］. J Dairy Sci，2001（84）：1140-1148.

［11］ Riffon R，Sayasith K，Khalil H，et al. Development of a rapid and sensitive test for identifi cation of major pathogens in bovine mastitis by PCR［J］. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（7） ：2584-2589.

［12］ 武守艳，韩一超，陈剑波，等. 奶牛乳房炎主要病原菌PCR检测方法［J］. 山西农业科学，2016，44（2）：232-235.

［13］ 肖颖，谷维娜，钱明明，等. 奶牛隐形乳房炎多重PCR检测方法研究［J］. 安徽农业科学，2010，38（17）：9029-9031.

［14］ 张善瑞，王长发，高运东，等. 应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌［J］. 家畜生态学报，2007，28（4）：78.

［15］ 伊岚. 奶牛乳房炎MTT检测方法的建立和药敏试验研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2006.

［16］ 崔传金.基于体细胞数的奶牛乳腺炎检测方法研究进展［J］. 安徽农业科学，2013，41（7）：2974-2975.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress on Diagnostic Techniques of Recessive Mastitis in Dairy Cows

Ma Jinmei1，2，Chi Liang1，Zou Ming1，Liu Huanqi1
（1. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109；2. Qixia Animal Health Supervision Institution，Qixia，Shandong 265300）

At the present time，the recessive mastitis has become one of the common diseases with high incidence in dairy cows，resulting in serious harm and great fi nancial loss in dairy industry. Major diagnostic techniques and methods of the disease were compared and analyzed in this article，including cell count，PH-value test of milk，conductivity detection of milk，milk bacterial culture，PCR assay and MTT test，so as to provide guidance for better selection and further study of the diagnosis method for recessive mastitis.

recessive mastitis in dairy cows；diagnostic technique；cell count；PH-value test of milk；conductivity detection of milk；milk bacterial culture；PCR assay；MTT test

S823

A

1005-944X（2016）11-0071-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.020

山东省现代农业产业技术体系创新团队项目（SDAIT-09-03）

刘焕奇