不同苜蓿品种对豌豆蚜中肠消化酶活性的影响

达丽婷，朱亚灵，宋丽雯，胡桂馨，王森山*

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，

甘肃 兰州730070；2.兰州市园林科学研究所，甘肃 兰州 730070)

不同苜蓿品种对豌豆蚜中肠消化酶活性的影响

达丽婷1，朱亚灵2，宋丽雯1，胡桂馨1，王森山1*

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，

甘肃 兰州730070；2.兰州市园林科学研究所，甘肃 兰州 730070)

摘要：为了探究取食苜蓿对豌豆蚜中肠消化酶的影响，揭示苜蓿抗蚜的生化机制，本文测定了2种色型豌豆蚜取食8个不同抗性苜蓿品种后中肠主要消化酶的活性。结果表明，红色型豌豆蚜在取食低抗品种渭南后，其中肠蛋白酶活性为(9.71±0.63)U/mL，绿色型豌豆蚜取食感虫品种猎人河后为(9.88±0.56)U/mL，二者取食高抗品种三得利后分别为(0.33±0.10)U/mL和(0.43±0.02)U/mL；红色型豌豆蚜取食感虫品种猎人河后其中肠脂肪酶活性为(4.12±0.30)U/mL，绿色型豌豆蚜则在取食低抗品种渭南后酶活达(4.00±0.29)U/mL，二者脂肪酶活性在取食高抗品种甘农5号后分别为(1.63 ±0.10)U/mL和(1.08±0.13)U/mL； 2种色型的豌豆蚜中肠淀粉酶的活性在取食感虫品种猎人河后分别为(2.30±0.40)U/mL、(2.14±0.29)U/mL。此外，豌豆蚜取食8个苜蓿品种后，红、绿色型豌豆蚜的蛋白酶、脂肪酶及绿色型豌豆蚜的淀粉酶活性与苜蓿抗性间均呈高度负线性相关，表明苜蓿品种的抗蚜性越高，蚜虫取食后其中肠3种酶的活性越低，抗性苜蓿品种主要抑制豌豆蚜中肠消化酶的活性。

关键词：豌豆蚜;苜蓿;蛋白酶;脂肪酶;淀粉酶;抗性

The effect of different alfalfa varieties on the midgut protease activity of pea aphid (Acyrthosiphonpisum)

DA Li-Ting1, ZHU Ya-Ling2, SONG Li-Wen1, HU Gui-Xin1, WANG Sen-Shan1*

1.MinistryofEducationKeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,Sino-U.S.CentersforGrazing-landEcosystemSustainability,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China；2.LanzhouResearchinstituteofGardening,Lanzhou730070,China

Abstract:This research measured the midgut protease enzyme activity in the red and green pea aphid (Acyrthosiphon pisum) after they had fed on 8 alfalfa (Medicago sativa) varieties with differing resistance. The midgut protease activity of the red pea aphid was (9.71±0.63) U/mL after they had fed on the variety Weinan, and was (0.33±0.10) U/mL after feeding on variety Sandili. The protease activity of the green pea aphid was (9.88±0.56) U/mL after feeding on the variety Hunter river, and (0.43±0.02) U/mL after feeding on Sandili. The midgut lipase activity of the red pea aphid was (4.12±0.30) U/mL when they infested the cultivar Hunter river, but was only (1.63±0.10) U/mL (P<0.05) when they infested the variety Gannong No.5. Lipase activity was (4.00±0.29) U/mL when aphids had fed on the variety Weinan, and was (1.08±0.13) U/mL when feeding on the cultivar Gannong No.5. The midgut amylase activities of the red and green pea aphids were (2.30±0.40) U/mL and (2.14±0.29) U/mL, respectively when they had fed on the cultivar Hunter river. In summary, for pea aphid infestation of 8 alfalfa varieties with differing aphid resistance, a high negative linear correlation was observed between the resistance of the different alfalfa varieties and the protease, lipase and amylase activities of the pea aphid, i.e. when the alfalfa aphid resistance is higher, the enzyme activity is lower. Hence it is concluded that the resistant alfalfa varieties restrict the midgut digestive enzyme activity of the pea aphid.

Key words:pea aphid (Acyrthosiphon pisum); alfalfa (Medicago sativa); protease; lipase; amylase; resistance

苜蓿(Medicagosativa)在我国有2000余年的历史，经过人工驯化和自然选择，形成了一些具有地方特色的优良品种[1-2]。苜蓿产量高，而且草质优良，各种畜禽均喜食，是全世界栽培面积最广的优质牧草[3-6]。在美国，苜蓿是次于小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)的第四大农作物，为美国创造了巨大的生态和社会效益[7]。而在我国，随着畜牧业的不断发展，草产业呈现出强劲的发展势头，特别是甘肃、新疆、内蒙古等西北地区，因其良好的饲料和食用价值，形成进出口产业链[8]。根据调查，西北地区由于苜蓿虫害的影响，常造成10%~30%的经济损失，其中苜蓿蚜虫类是最重要的害虫类群之一[9-10]。在甘肃危害苜蓿的蚜虫主要有3种：苜蓿蚜(Aphismedicaginis，PA)，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum，BBA)和苜蓿斑蚜(Therioaphistrifolii，SAA)。近几年，由于气候、环境条件的复杂变化，甘肃兰州苜蓿田的蚜虫种群也发生了很大的变化，2004-2005年苜蓿田的蚜虫种群以苜蓿斑蚜为主；2006年苜蓿田的蚜虫发生量很少；2007年苜蓿斑蚜的发生高峰期提前到了5月份，6月份苜蓿斑蚜的发生量下降，豌豆蚜的蚜量上升，超过苜蓿斑蚜，成为苜蓿田优势种群；2008年苜蓿田的蚜虫种群以豌豆蚜为主；从以上蚜虫种群的发生动态可以看出，豌豆蚜正在从苜蓿田的次要害虫上升为主要害虫[11]。

豌豆蚜亦叫豆无网长管蚜，是苜蓿上常见的重要害虫，世界各地均有分布。豌豆蚜有2种生物型：红色型和绿色型。1945年，Harrington[12]首次发现红色型的豌豆蚜，之后国内外学者对豌豆蚜及其生物型广泛开展研究，Kugler和Ratcliffe[13]评价苜蓿对红色型豌豆蚜的抗性时发现，对绿色豌豆蚜有抗性的苜蓿对红色型豌豆蚜抗性很低或者丧失了抗性。在我国，武德功等[3]通过组建生命表评价了5个苜蓿品种对2种色型豌豆蚜的抗生性。金娟等[14]研究了不同苜蓿品种对2种生物型豌豆蚜的抗生性表明，同一苜蓿品种和不同苜蓿品种之间对2种色型豌豆蚜的抗生性都存在差异，说明豌豆蚜色型的分化给抗蚜品系的培育带来了更多的挑战。

苜蓿抗蚜育种是防治该虫最有效的途径之一，而明确的抗性机制是高效抗虫育种的基础。目前国内对苜蓿抗蚜机制的研究，主要集中在苜蓿体内的营养物质[15]、抗虫过程中的相关酶[16-17]及次生代谢产物在蚜虫为害前后变化与作物抗虫性之间的关系[11,14,17]等方面。王森山[18]通过室内和大田抗蚜评价、筛选，采用ISO9648法测定4个不同抗蚜级别苜蓿品(种)系感蚜前后单宁含量，初步揭示了苜蓿对苜蓿斑蚜的抗性机制及抗性生理生化机制。研究表明苜蓿对苜蓿斑蚜的抗性以抗生性为主，不同抗性苜蓿品种由于蚜虫的危害，植株内单宁含量发生变化，随着苜蓿品种单宁含量增加，蚜害指数降低，苜蓿品种的抗虫性提高。曲若轶等[19-20]报道单宁抗虫机理包括：与昆虫的中肠肠壁蛋白质结合，促使蛋白质沉淀，影响中肠的渗透性和对蛋白质、氨基酸等重要营养物质的吸收、消化和利用；抑制昆虫中肠消化酶的活性；降低血淋巴中糖及蛋白质含量等。而对于豌豆蚜为害苜蓿后单宁对其抗性是影响其对蛋白质、氨基酸等营养物质的吸收和利用有待研究证明。

蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶是昆虫中肠重要的消化酶，近年来国内已有研究者就蛾类、蚁类、蜜蜂等昆虫的中肠消化酶活性进行了研究[21-25]。然而，就取食苜蓿后，红绿两种色型豌豆蚜中肠内酶活性的研究还比较少。为了揭示苜蓿抗蚜生化机制，在对国内外主栽苜蓿品种田间抗蚜性鉴定的基础上[26-28]，利用甘农5号等不同抗性水平的苜蓿品种为供试材料，测定豌豆蚜在不同苜蓿品种上取食后中肠消化酶的活性，探究豌豆蚜取食苜蓿后生理的变化，为揭示苜蓿对豌豆蚜抗性的生化机制奠定理论基础。

1材料与方法

1.1　供试材料

1.1.1供试虫源从甘肃农业大学苜蓿试验田采集豌豆蚜成蚜，将其置于实验室25℃恒温箱中，用鲜苜蓿叶片饲养，以12 h以内的初产若蚜作为供试虫源。

1.1.2供试苜蓿品种供试苜蓿品种及其来源详见表1所示。

表1　苜蓿品种及来源

* 表中抗蚜株率为2013年田间抗蚜性评价结果[28]。Rate of resistant plants in Table is the result of field evaluation in 2003[28].

1.2　测定方法

1.2.1试虫的采集与酶液的制备在苜蓿生长的幼苗期，分别接红、绿2种色型的豌豆蚜初产若蚜若干于各供试苜蓿品种上，置于温度(23±1)℃，光周期L∶D=16∶8，相对湿度RH=(70±5)%的条件下饲养，待其生长发育为成蚜后，从每个苜蓿品种上采集两种色型成蚜各20头，重复3次。将待测豌豆蚜去头，释放其血淋巴后，抽取中肠并加入1 mL预冷的0.15 mol/L NaCl溶液，将其冰浴匀浆并在4℃下11000 r/min离心20 min，取上清液为酶提取液置于4℃下备用，48 h内测定[29]。

1.2.2蛋白酶活性测定参照沙槎云等[23]的方法。以酪蛋白为底物，酪蛋白以20 mg/mL的浓度溶于0.15 mol/L NaCl溶液。取酶液0.1 mL加入1 mL酪蛋白溶液中，加缓冲液使最终体积达到4 mL，37℃水浴30 min，取上清液0.25 mL，加folin酚甲1.25 mL，folin酚乙0.25 mL，在波长425 nm处测吸光值。将酶液以等量的0.15 mol/L NaCl溶液替代作为对照。参照《酶的测定方法》[30]中的方法，将测得的吸光值转化为酶活性。计算公式为：

式中，ΔA为吸光值，V为反应总体积，VE为反应酶液体积，t为反应时间。

1.2.3脂肪酶活性测定脂肪酶的活性测定用对硝基苯酚法[31-33]。以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在420nm波长下测出其吸光光度值，将酶液以等量的0.15mol/LNaCl溶液替代作为对照，方法同处理。酶活性单位定义为检测条件下每min产生1μmol对硝基苯酚所需的脂肪酶量。参照《昆虫生化与分子生物学实验技术》[29]中的方法，将测得的吸光值转化为酶活性。计算公式为：

式中，ΔA为吸光值，t为反应时间，VE为反应酶液量。

1.2.4淀粉酶活性测定参照Stellmach[30]《酶的测定方法》(1992)中伯恩费尔德法。以0.1%的淀粉水溶液为底物，在0.02mol/LpH8.0的磷酸缓冲液中，0.1mL酶液与0.2mL的淀粉水溶液反应，DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂染色，在波长492nm处测吸光值。将酶液以等量的0.15mol/LNaCl溶液替代作为对照，方法同处理。参照《酶的测定方法》[30]中的计算方法，将测得的吸光值转化为酶活性。计算公式为：

式中，ΔA为吸光值，VE为反应酶液量。

1.3　数据处理

应用Microsoftofficeexcel2007及SPSS19.0软件对调查数据进行处理，采用ANOVA单因素方差分析。

供试8个抗蚜性不同的具有代表性的苜蓿品种，以其田间抗蚜性株率为自变量(X)，豌豆蚜中肠消化酶活性为因变量(Y)进行相关性分析，计算回归方程Y=a+bX，并利用F检验法进行显著性检验。

2结果与分析

2.1　豌豆蚜2种生物型中肠消化酶活性的测定结果

2.1.1豌豆蚜2种生物型中肠蛋白酶的活性在室温(23±1)℃条件下，测定了取食8种苜蓿后2种色型豌豆蚜中肠蛋白酶活性，结果见表2。

表2结果表明，豌豆蚜取食为害8种苜蓿品种后，其中肠内蛋白酶活性存在差异。红色型豌豆蚜的中肠酶活性范围在(9.71±0.63)~(0.33±0.10)U/mL之间，取食低抗品种渭南的达(9.71±0.63)U/mL，高抗品种三得利的为(0.33±0.10)U/mL。低抗品种渭南与感虫品种猎人河之间酶活性差异不显著(P>0.05)，渭南、猎人河与其余6种供试苜蓿品种间差异显著 (P<0.05)；高抗品种三得利、甘农5号、陇东，抗虫品种金皇后间差异不显著(P>0.05)。

绿色型豌豆蚜的中肠蛋白酶活性在感虫品种猎人河上达(9.88±0.56)U/mL，与渭南间差异不显著(P>0.05)， 猎人河、渭南与其他6个供试品种间差异显著(P<0.05)；高抗品种三得利上的酶活性为(0.43±0.02)U/mL。高抗品种三得利、甘农5号、陇东，抗虫品种金皇后间差异不显著(P>0.05)。

2.1.2豌豆蚜2种生物型中肠脂肪酶的活性表3结果显示，豌豆蚜取食为害8种苜蓿品种后，红色型豌豆蚜中肠内的脂肪酶活性在(4.12±0.30)~(1.63±0.10)U/mL之间，其中取食感虫品种猎人河后的酶活达(4.12±0.30)U/mL，高抗品种甘农5号的为(1.63±0.10)U/mL；猎人河、渭南与甘农3号、天水及三得利、甘农5号、陇东、金皇后等供试苜蓿品种间差异显著 (P<0.05)，猎人河和渭南、甘农3号间及天水、三得利、甘农5号、陇东、金皇后品种间差异不显著(P>0.05)。

表2　取食8种苜蓿后2种色型豌豆蚜中肠蛋白酶活性

表3　取食8种苜蓿后2种色型豌豆蚜中肠脂肪酶活性

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Data in the same columns followed by the different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level, the same below.

而绿色型豌豆蚜中肠内的脂肪酶活性在(4.00±0.29)~(1.08±0.13) U/mL之间，其中取食低抗品种渭南后的酶活达(4.00±0.29) U/mL，高抗品种甘农5号的为(1.08±0.13) U/mL；感虫品种猎人河与低抗品种渭南之间差异不显著(P>0.05)， 猎人河、 渭南与其余6种供试苜蓿品种间差异显著 (P<0.05)， 高抗品种甘农5号与金皇后、天水、甘农3号、猎人河、渭南之间差异显著 (P<0.05)。

2.1.3豌豆蚜2种生物型中肠淀粉酶活性的测定表4结果表明，红色型豌豆蚜在取食感虫品种猎人河后其中肠淀粉酶活性为(2.30±0.40) U/mL，与渭南、甘农3号和甘农5号3个品种间差异显著(P<0.05)。

绿色型豌豆蚜取食感虫品种猎人河后其中肠淀粉酶活性最高，为(2.14±0.29) U/mL，与其他7个供试品种间差异显著(P<0.05)；取食抗虫品种甘农3号后其中肠淀粉酶活性为(0.87±0.12) U/mL，与天水、猎人河间差异显著(P<0.05)。

2.2　豌豆蚜中肠消化酶活性与苜蓿抗性相关性分析

表4　取食8种苜蓿后2种色型豌豆蚜中肠淀粉酶活型

以8种不同抗性的苜蓿品种的抗蚜株率为自变量(X)，豌豆蚜中肠消化酶活性为因变量(Y)进行相关性分析，计算出其回归方程，结果见表5。

表5结果显示，豌豆蚜取食8个不同抗性苜蓿品种后，苜蓿品种的抗性与豌豆蚜中肠主要消化酶活性间均呈负线性相关，其中与红、绿色型豌豆蚜蛋白酶和脂肪酶活性及绿色豌豆蚜淀粉酶活性间均呈高度正线性相关(P<0.01)，与红色豌豆蚜淀粉酶活性间相关性不显著。两种生物型的豌豆蚜取食8种不同抗性的苜蓿品种后，主要消化酶活性均受到影响，苜蓿品种的抗蚜性越高，蚜虫取食后其中肠3种消化酶的活性越低。

表5　豌豆蚜中肠消化酶活性与苜蓿抗性的相关性分析

注：**表示在0.01 水平(双侧)上极显著相关，*表示在0.05 水平(双侧)上显著相关。

Note：**represents significant difference at 0.01 level (two-sided ), * represents significant difference at 0.05 level (two-sided).

3小结与讨论

3.1　蛋白酶

结果表明，豌豆蚜取食为害8种供试不同抗性级别的苜蓿品种后，对其中肠内蛋白酶活性的影响显著。2种色型豌豆蚜在低抗品种渭南和感虫品种猎人河上的酶活性均显著高于其他供试苜蓿品种；在高抗品种三得利和甘农5号上的酶活性显著低于其他品种，说明酶活性与苜蓿的抗性级别有着紧密的联系，即抗性越强，酶活性越低。

红绿色型豌豆蚜中肠蛋白酶活性在8种供试苜蓿品种上均随抗性减弱而呈上升趋势。两种色型的豌豆蚜中肠内蛋白酶活性与苜蓿品种的抗性间均呈现出高度负线性相关，苜蓿品种抗性越强，其中肠内蛋白酶活性就越弱，说明苜蓿抗性对豌豆蚜中肠内蛋白质酶有较大的影响，当豌豆蚜获得较多蛋白质后，抗性品种上豌豆蚜的蛋白酶活性降低，从而影响豌豆蚜对蛋白质的消化，这一结果与王森山[18]和戴小枫等[34]的研究结果相吻合。

3.2　脂肪酶

试验结果表明，红绿2种色型豌豆蚜取食为害8种不同抗性级别的苜蓿品种后，其中肠脂肪酶活性受到显著影响，红绿色型豌豆蚜脂肪酶酶活均在高抗品种甘农5号上最低，红色型豌豆蚜中肠脂肪酶活性在感虫品种猎人河上最高，绿色型在低抗品种渭南上最高，且红色型豌豆蚜的中肠脂肪酶活性均高于绿色型。

豌豆蚜取食8个苜蓿品种后，红色型豌豆蚜的中肠脂肪酶活性均高于绿色型，在高抗品种甘农5号和三得利上差异显著，且不同苜蓿品种抗性和红绿色型豌豆蚜体内脂肪酶活性均呈高度负线性相关，说明高抗品种对豌豆蚜脂肪酶酶活的影响较大。

3.3　淀粉酶

试验结果显示，豌豆蚜取食为害这8种苜蓿品种后，红绿两种色型的豌豆蚜体内中肠淀粉酶的活性均在感虫品种猎人河上最高，在其余7个品种上与抗性没有表现出明显的一致性。但红色型豌豆蚜的酶活性在8个品种上都高于绿色型，这与Seyed等[35]的2013年的研究结果不同色型的豌豆蚜体内的能量积累方式不同，绿色型豌豆蚜的蛋白质含量明显高于红色型豌豆蚜，但是脂肪和可溶性碳水化合物含量较低，而红色型豌豆蚜最丰富的能量存储是脂肪和可溶性碳水化合物的这一结果相近。

此外，绿色型的豌豆蚜的淀粉酶活性与8个苜蓿品种的抗性间呈现出高度的负线性相关，即苜蓿品种抗性越强，红色型豌豆蚜中肠内淀粉酶活性就越弱，说明苜蓿抗性对豌豆蚜中肠内淀粉酶有较大的影响。

综上所述，这3种酶的活性都与苜蓿品种的抗性表现出高度负线性相关，这说明，在一定程度上苜蓿品种的抗性对红绿色型中肠内的消化酶活性产生了显著的影响，即苜蓿品种抗性越强，豌豆蚜中肠内酶活性就越弱。 这一显著的影响可能与抗性苜蓿品种中影响酶活性的某种生化物质有关，具体的生化抗性物质及其抗性机理尚不清楚，需进一步研究。

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《植物遗传资源学报》征订启事

《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊，为中国科技论文统计源期刊、中国科学引文数据库来源期刊(核心期刊)、中国核心期刊(遴选)数据库收录期刊、中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊，又被《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库收录。据中信所2014年期刊学术影响因子年报统计，《植物遗传资源学报》影响因子为1.146(综合影响因子1.396)，在全国农艺和园艺类期刊中排名第5，在全国1998种科技核心期刊中排名157位。

报道内容为大田、园艺作物，观赏、药用植物，林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资源基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如，种质资源的考察、收集、保存、评价、利用、创新，信息学、管理学等；起源、演化、分类等系统学；基因发掘、鉴定、克隆、基因文库建立、遗传多样性研究。

双月刊，大16开本，196页。定价20元，全年120元。各地邮局发行。

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http://cyxb.lzu.edu.cn

达丽婷，朱亚灵，宋丽雯，胡桂馨，王森山. 不同苜蓿品种对豌豆蚜中肠消化酶活性的影响. 草业学报, 2015, 24(10): 80-87.

DA Li-Ting,ZHU Ya-Ling,SONG Li-Wen,HU Gui-Xin,WANG Sen-Shan. The effect of different alfalfa varieties on the midgut protease activity of pea aphid (Acyrthosiphonpisum). Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(10): 80-87.

通讯作者*Corresponding author. E-mail:wangsenshan@gsau.edu.cn

作者简介：达丽婷(1987-)，女，甘肃兰州人，在读硕士。E-mail: zhida0504@foxmail.com

基金项目：草业生态系统教育部重点实验室开放基金科研项目(CYZS-2011015)资助。

收稿日期：2014-11-13；改回日期：2015-01-04

DOI：10.11686/cyxb2014470