现代分析技术在冬虫夏草质量评价中的应用△

钱正明，廖娜，李文庆，艾中，田野，李文佳

(广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523808)

现代分析技术在冬虫夏草质量评价中的应用△

钱正明，廖娜，李文庆，艾中，田野，李文佳*

(广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523808)

冬虫夏草为我国传统名贵中药，其具有良好的药用功效及经济价值。本文介绍了现代分析技术在冬虫夏草质量评价研究中的应用，包括色谱技术(薄层色谱、液相色谱、气相色谱和电泳色谱)、波谱技术(紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振谱、原子光谱和质谱)和分子生物技术(核酸分子鉴定技术和蛋白质分子鉴定技术)。

冬虫夏草；色谱技术；波谱技术；分子生物技术

冬虫夏草为我国传统名贵中药，具有补肾益肺、止血化痰的功能[1]。现代研究表明其具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等作用[2-6]。由于冬虫夏草良好的药用功效和人们健康意识的提高，近年来市场需求量逐年增加，供不应求。目前市场上冬虫夏草品类繁多，质量参差不齐，因此其品质评价研究已经引起了人们越来越多的重视。现代分析技术也被大量运用于冬虫夏草质量评价研究，如：色谱技术、波谱技术和分子生物技术。本文就近年来现代分析技术在冬虫夏草质量评价研究中的应用进行了介绍和总结，为冬虫夏草质量评价研究工作提供科学参考。

1 色谱技术

色谱分析技术已成为中药质量评价中最为常用的技术，其在冬虫夏草定性和定量研究中得到了广泛的应用，主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和电泳色谱法。

1.1 薄层色谱法

薄层色谱法具有操作方便、结果直观、多样品同时分析等特点，在冬虫夏草定性定量分析中均有应用。

本研究组采用薄层色谱技术建立了鉴别冬虫夏草存储年限的定性分析方法[7]。首先制备冬虫夏草供试品溶液和麦角甾醇对照品溶液，然后对供试品溶液和对照品溶液进行薄层层析，在365 nm紫外灯下检视，通过比较冬虫夏草供试品溶液中麦角甾醇斑点和麦角甾醇紧邻斑点在薄层色谱上的亮度，即可判断冬虫夏草储存年限在1年以内、2年以内或2年以上。傅道珍[8]建立了一种可以鉴别冬虫夏草和4种伪品的薄层色谱分析方法，在其建立的薄层分析条件下冬虫夏草有8个紫红色斑点，新疆虫草有6个紫红色斑点和1个蓝色斑点，而亚香棒虫草、地蚕和人工伪制品则没有明显斑点。Wu D T等[9]将薄层色谱和糖凝胶电泳技术应用于冬虫夏草多糖特征分析，结果显示冬虫夏草多糖中存在1，4-α-D-葡萄糖苷键、1，4-β-D-葡萄糖苷键和1，4-α-D-半乳糖苷键，冬虫夏草和虫草菌丝体的多糖薄层图谱不一致。

薄层色谱在冬虫夏草定量分析方面也有文献报道。米莉莉等[10]建立了冬虫夏草核苷类成分的薄层色谱定量分析方法，对冬虫夏草核苷类成分进行薄层分离后，在270 nm处进行薄层扫描测定，结果显示冬虫夏草中主要核苷为腺苷和尿苷。汪宝琪等[11]采用薄层色谱技术对冬虫夏草中D-甘露糖进行分离后，用高碘酸钾-联苯胺显色，在295、370 nm处进行双波长反射法锯齿形薄层扫描，测得西藏产冬虫夏草中甘露醇的含量为8.4%。

1.2 高效液相色谱法

高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和灵敏度高等优点，是目前冬虫夏草质量评价中运用最多的分析技术。同时高效液相色谱技术可以根据分析物性质的不同采用不同检测器进行检测分析。

紫外检测器是液相色谱最常用的检测器，通常用来检测具有紫外吸收的物质，如冬虫夏草中的核苷类和甾醇类化合物。核苷类成分腺苷是《中华人民共和国药典》规定的冬虫夏草含量测定项的指标[1]，其分析通常采用反相色谱模式分离，检测波长多为260 nm[12-14]。本研究组[12]建立了高效液相色谱-紫外检测法同时测定冬虫夏草中5种核苷类成分的含量，色谱柱为ZORBAX SB-Aq，检测波长为260 nm，并用所建立的方法对6批冬虫夏草样本的不同部位进行了核苷含量测定，结果显示冬虫夏草子座中总核苷含量>全草总核苷含量>虫体总核苷含量。常规液相色谱柱分析冬虫夏草核苷类成分耗时较长，需30～60 min[13-14]。本研究组[15]在前期研究基础上利用高效液相色谱-紫外检测技术建立了一种快速分析冬虫夏草中核苷类成分的方法，色谱柱为Poroshell，检测波长为260 nm，在15 min内完成了6种核苷成分(尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素)的分离，并成功运用于冬虫夏草样本中的核苷含量的测定。甾醇也是冬虫夏草中的一类重要活性成分，通常采用反相液相模式进行检测，检测波长在280 nm左右。张薇薇等[16]测定了11批冬虫夏草中麦角甾醇的含量，结果显示不同批次间冬虫夏草麦角甾醇含量差异明显。此外，也有报道用高效液相色谱-紫外检测技术结合柱前衍生的方法分析冬虫夏草中原本无紫外吸收的化合物。Guan J等[17]采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生结合高效液相-紫外检测器的方法，对冬虫夏草多糖酶解后的单糖成分进行了分析。王丽等[18]采用柱前邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在线自动衍生结合高效液相色谱-二极管阵列检测器-荧光检测器的方法，对5种不同产地的冬虫夏草氨基酸含量进行了分析。

冬虫夏草中没有紫外吸收的化合物，通常使用示差折光检测器(RID)和蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测。刘谋盛等[19]建立了HPLC-RID法测定冬虫夏草中甘露醇含量，样品水提液经反相C18柱预分离后，采用阳离子交换柱进行分离，RID检测，结果显示2个冬虫夏草样本中甘露醇含量分别为6.52%和6.38%。周丹蕾[20]采用HPLC-ELSD对冬虫夏草中海藻糖、甘露醇和麦芽三糖进行了分析，结果显示该方法不仅可用于多个糖类成分的同时测定，同时还首次发现了冬虫夏草中海藻糖的存在。Guan J等[21]采用HPLC-ELSD对冬虫夏草水溶性多糖进行了分析，测试样本经由凝胶柱分离，ELSD检测，结果显示冬虫夏草水溶性多糖主要分为2个色谱峰，第一个多糖峰分子量大于400 kDa，第二个多糖峰分子量在10～80 kDa。

质谱检测器具有能提供结构信息、灵敏度高等优点。本研究组[22]采用高效液相-四级杆飞行时间质谱技术(HPLC-QTOF/MS)建立了冬虫夏草高效液相特征图谱，利用和对照品或文献核对质谱数据的方法，鉴定了其中的9个化合物，包括尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、腺苷、腺嘌呤和虫草素，其中脱氧鸟苷为首次从冬虫夏草中发现。Fan H等[23]采用高效液相-质谱技术(HPLC-MS)对冬虫夏草中的核苷类成分进行定性和定量分析，样品采用加压溶剂萃取法提取，经ZORBAX Eclipse XDB-C18柱分离后MS检测，结果在冬虫夏草中检测出43种核苷类化合物，鉴定了其中的16种成分，并对13种核苷类成分进行了定量分析，结果显示质谱检测器定量具有准确灵敏的优点。Hu H K等[24]采用高效液相-质谱技术对冬虫夏草样品进行了分析，并在冬虫夏草样品中首次发现了环丙氨酸-亮氨酸-鼠李糖苷和苯丙氨酸-葡萄糖苷。

液相色谱可以同时连接多个检测器，对冬虫夏草中的多类成分同时进行分析。顾振宇等[25]采用HPLC-DAD-RID法同时分析了冬虫夏草中虫草素和虫草酸的含量，虫草素采用紫外检测器进行检测，虫草酸则用示差检测器进行检测。Wang S等[26]建立了一种HPLC-DAD-ELSD联用同时定量分析冬虫夏草中8种核苷及其碱基、3种糖类及多球壳菌素的方法，采用Prevail Carbohydrate ES糖柱对冬虫夏草中的成分进行分离，使用DAD在254 nm处检测核苷类成分，ELSD检测糖类及多球壳菌素。陈林琤等[27]采用HPLC-UV-MS法对西藏冬虫夏草中的麦角固醇及其衍生物进行了定性定量分析，首先用高效液相-质谱对冬虫夏草提取物液中的化合物进行定性分析，对冬虫夏草中麦角固醇及其衍生物进行了质谱鉴定，并用高效液相-紫外检测器技术对其中的麦角固醇进行了含量测定。

1.3 气相色谱法

气相色谱(GC)是一种以气体为流动相的色谱法，由于其灵敏度高、分析速度快、样品量少而得到广泛的应用。冬虫夏草中的脂肪酸、甾醇、糖类及挥发性成分均可用GC进行分析。

Yang F Q等[28]采用气相色谱技术对冬虫夏草中4种甾醇和10种脂肪酸进行了定量分析，结果发现棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸是冬虫夏草中主要的脂肪酸，麦角甾醇是其主要的甾醇类化合物。Guan J等[29]建立了GC-MS分析冬虫夏草中的糖类成分的方法，通过加压溶剂萃取法提取冬虫夏草中多糖，三氟乙酸水解，盐酸羟胺衍生化，然后采用GC-MS进行分析检测，结果显示冬虫夏草中多糖的主要组成糖为葡萄糖、半乳糖和甘露糖。凌建亚等[30]采用超临界CO2萃取结合GC-MS技术对冬虫夏草子座中挥发性成分进行了分析，从中鉴定了39种化合物，它们主要为不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、酯及烷烃类化合物。

1.4 电泳色谱法

电泳色谱是指根据化合物在单位电场强度作用下迁移速度的不同从而达到分离的分析方法。目前在冬虫夏草分析中较为常用的有毛细管电泳和平板电泳。

1.4.1 毛细管电泳法 毛细管电泳(CE)具有高效、快速、有机溶剂消耗少等特点。Gong Y X等[31]采用高效毛细管区带电泳法同时分析了冬虫夏草中6种核苷和碱基，发现缓冲液浓度、pH值和改性剂乙腈的浓度是影响实验的关键性因素，并确定了最佳实验条件，电泳缓冲盐为500 mmol·L-1硼酸，pH值为8.6，改性剂乙腈为12.2%。Yang F Q等[32]利用CE-MS联用技术建立了同时测定冬虫夏草中包括胞嘧啶、腺嘌呤、虫草素、腺苷等12种核苷及碱基的定量分析方法，分析结果显示CE-MS不仅具有CE的优点，同时兼备了MS定性及高灵敏度的优势。此外，毛细管电泳色谱(CEC)也被成功运用于冬虫夏草核苷类成分的定量分析[33]。

1.4.2 平板电泳技术 任艳等[34]运用双向电泳技术对不同产地、不同加工方式的冬虫夏草中可溶性蛋白质进行了分析，发现不同产地和不同加工方法会造成冬虫夏草的可溶性蛋白的差异。石继红等[35]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对天然冬虫夏草和冬虫夏草菌丝体中的蛋白质亚基进行了分析，发现天然冬虫夏草中含有9种亚基，而后者只有7种。

2 波谱技术

波谱分析是现代分析中一类极其重要的分析手段，其主要利用物质的波谱特征进行定性或定量分析。常见的波谱分析方法包括紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振谱、原子光谱和质谱。

2.1 紫外-可见光谱

该法是根据待测物溶液对紫外光的吸收特性所建立起来的一种定性和定量分析方法。紫外光谱具有操作简单和仪器普及的优点。本研究组利用紫外光谱技术开发了定性鉴别冬虫夏草中是否混有发酵冬虫夏草菌粉的分析方法[36]。首先将一定浓度的腺苷溶液作为参比溶液在220～350 nm进行紫外扫描，再对待测冬虫夏草粉末样本30%乙醇提取液进行紫外扫描，观察其紫外光谱在275～250 nm区段内是否存在负吸收值，如果样本无负吸收值则表明冬虫夏草粉末中混入了发酵冬虫夏草粉。此外也有文献报道利用紫外光谱技术对冬虫夏草与其他虫草进行定性鉴别分析，如冬虫夏草95%乙醇提取液在200～400 nm波长有4个最大吸收波长，而亚香棒虫草95%乙醇提取液在此波段只有两个最大吸收波长[37]。

紫外-可见光谱除了用于冬虫夏草定性鉴别外，还被用于冬虫夏草活性成分的含量测定。索菲娅等[38]建立了冬虫夏草中甘露醇、多糖含量的紫外测定法，以高碘酸钠为反应试剂在412 nm处测定D-甘露醇的含量；苯酚-硫酸为反应试剂在490 nm处测定冬虫夏草多糖含量，并用所建立的方法对3个不同产地冬虫夏草样本中的甘露醇和多糖进行了含量测定。白云娥等[39]用硫酸-蒽酮作为反应试剂，以624 nm为检测波长也成功建立了冬虫夏草多糖含量测定方法。

2.2 红外光谱

红外光谱是根据化合物在红外光照射下，分子中的化学键或官能团振动的原理来显示结构信息。根据波长的不同可分为近红外光谱、中红外光谱和远红外光谱。目前应用在冬虫夏草质量评价研究中的技术主要为近红外光谱技术和中红外光谱技术。

王钢力等[40]建立了冬虫夏草近红外光特征谱，并用TQ定量分析软件对102批不同产地(青海和西藏)冬虫夏草样品近红外光谱进行了判别分析，结果显示所建立方法可以对不同产地的冬虫夏草进行较好的区分。石岩等[41]利用近红外光谱技术建立了冬虫夏草中总氨基酸及主要氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸)的含量测定方法，首先对样本特征波段的近红外光谱数据和通过氨基酸自动分析仪获得的总氨基酸及各氨基酸含量数据进行数学建模，获得相关数学模型；然后利用所得数学模型和待测冬虫夏草样本近红外光谱数据即可获得待测样本的氨基酸含量。此外，Xie C Q等[42]采用傅里叶变换近红外技术对发酵冬虫夏草菌丝体中精氨酸的含量进行了测定。

宋文军[43]运用中红外光谱技术对冬虫夏草进行了分析，得到了冬虫夏草的特征吸收峰，分别为脂类(1746、1656 cm-1)、蛋白质(1549、1155 cm-1)和多糖(1082、1023 cm-1)。Yang P等[44]对冬虫夏草和伪品(地蚕和草石蚕)进行了二维红外图谱分析，结果发现冬虫夏草二维红外光谱670～780 cm-1×1400～1700 cm-1段的吸收峰可用于鉴别冬虫夏草和伪品，正品冬虫夏草在该波段有数个显著的峰值，而伪虫草则无显著峰值。

2.3 核磁共振谱

核磁共振谱是利用化合物原子核对射频辐射的吸收而建立起来的波谱技术，它是目前对化合物结构进行定性、定量分析的最强有力的工具之一。本研究组[45]通过对21批野生冬虫夏草(西藏7批、青海7批和四川7批)进行氢谱分析，建立了冬虫夏草核磁特征图谱，并找到了其核磁特征吸收峰；再利用所建立的冬虫夏草特征谱图对30批冬虫夏草野生抚育品和4种冬虫夏草混淆品(中华被毛孢菌丝粉、虫草花、蝉花、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉)进行核磁谱特征峰对比分析，结果表明野生冬虫夏草和冬虫夏草野生抚育品核磁特征谱特征峰一致，而冬虫夏草混淆品则存在明显的核磁特征峰缺失，因此该方法可用于定性鉴别冬虫夏草真伪。Nie S P等[46]使用核磁共振技术对冬虫夏草多糖进行了分析，结果显示冬虫夏草极性多糖的主链是由葡萄糖以1-4和1-3糖苷键连接，支链的葡萄糖主要连接在主链葡萄糖的2、6位上，微量甘露糖和半乳糖一般随机连接在支链上。

2.4 原子光谱

原子光谱是由原子中的电子在能量变化时所发射或吸收的一系列波长的光所形成的光谱。其包括原子吸收光谱、原子发射光谱和原子荧光光谱。原子吸收光谱具有选择性强、灵敏度高和分析范围广等优点，已被成功应用于冬虫夏草微量元素和重金属元素的测定。卑占宇等[47]利用该技术成功分析了冬虫夏草中6种微量元素(铁、铜、锌、锰、镁、钙)的含量。王钢力等[48]用原子吸收分光光度法对14批不同产地冬虫夏草中的砷、汞、铜、铅和镉的残留量进行了测定，结果显示所有冬虫夏草样本中汞、铜、铅和镉的残留量较低，但砷的含量14批样品中有13批超过药用植物及制剂绿色行业标准。此外，原子发射光谱和原子荧光光谱也有用于冬虫夏草微量元素和重金属残留分析。韩涛等[49]用电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)测定冬虫夏草中微量元素(钙、钾、镁、钠、磷、铜、铁、锰、镍、锌、砷、镉)含量，结果发现冬虫夏草中钠、磷、钙、钾、镁含量丰富。师存杰等[50]采用原子荧光光谱法测定冬虫夏草中砷和汞，并成功运用于4个冬虫夏草样本的检测。

2.5 电感耦合等离子体质谱

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)具有灵敏度高、同时测定多元素及测定同位素比值的优点。潘清灵等[51]用微波消解ICP-MS法测定22个西藏不同地区的冬虫夏草中12种微量元素，结果显示对人体有益的钾、钠、钙、镁、铝、铁元素在冬虫夏草中含量较为丰富。汪琼等[52]也用该技术对冬虫夏草不同部位中的30个微量元素进行了分析，结果显示冬虫夏草中含有11种人体必需的微量元素(钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、硒、钼、锡)，其子座和虫体中微量元素的含量差异较大。

3 分子生物学技术

分子生物学技术在冬虫夏草质量研究中主要用于其真伪鉴别。按照技术特征可以分为核酸分子鉴定技术和蛋白质分子鉴定技术，该内容本研究组在前期发表的论文中已进行了详细综述[53]，在此仅作简单总结。核酸分子鉴定技术在冬虫夏草中的应用主要包括：基于ITS序列的条形码技术、基于聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定技术及环介导等温扩增法(LAMP)鉴定技术[54-58]。Li X等[54]采用基于ITS序列的条形码技术成功鉴别冬虫夏草和5种伪品(古尼虫草、蝉蛹草、垂虫草、蛹虫草和罗伯茨虫草)。PCR分子鉴定技术在冬虫夏草中的应用包括随机扩增多态性技术(RAPD)和扩增片段长度多态性技术(AFLP)，Feng K等[55]利用RAPD技术对冬虫夏草及其混淆品进行了很好的区分。Wong Y L等[56]利用PCR结合侧向流层析技术建立了快速鉴别冬虫夏草和伪品(古尼虫草和蛹虫草)的分析方法。李奎等[59]采用环介导等温扩增(LAMP)实现了冬虫夏草特异性扩增，可用于区别冬虫夏草混淆品。此外，李杨[60]利用蛋白免疫技术对冬虫夏草进行了鉴别研究，首先对冬虫夏草中的抗原进行提取、纯化，并制备抗体，采用金标法检测待测样本中冬虫夏草抗原，由此判定冬虫夏草的真伪。

4 结语

综上所述，随着科学技术的发展，大量现代化分析技术被运用于冬虫夏草的质量评价研究，这为市场上冬虫夏草及其相关产品的品质评价提供了技术支撑，有利于提升冬虫夏草行业的质量评价水平。但目前报道的冬虫夏草分析方法大多集中于成分的分析，对其性状评价仍然为传统方法，存在着主观经验为主，难以客观化和标准化的问题。现代感官评价技术，如电子鼻、电子舌和电子眼等现代技术可以弥补以上缺点，近年来这些技术已有报道应用于其他中药材的质量评价研究[61-63]，未来也可尝试用于冬虫夏草的质量评价研究。总之，冬虫夏草质量评价研究将随着现代分析技术的发展不断完善，新技术的应用及多技术的联合应用将成为冬虫夏草质量评价方法发展的重要方向。

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ApplicationofModernInstrumentalAnalyticalTechniquesinQualityEvaluationofCordycepssinensis

QIAN Zhengming，LIAONa，LIWenqing，AIZhong，TIANYe，LIWenjia*

(GuangdongSunshineLakePharmaCo.，LTD，Dongguan523808，China)

Cordycepssinensisis a traditional and valuable Chinese medicine，which has a good medicinal and economic value.This paper reviewed the modern instrumental analytical techniques in quality evaluation ofC.sinensis，including chromatographic technique (thin layer chromatography，high performance liquid chromatography，gas chromatography and electrophoresis)，spectroscopic technique (ultraviolet spectroscopy，infrared spectroscopy，nuclear magnetic resonance spectroscopy，atomic spectroscopy and mass spectrum) and molecular biological technique (identification of nucleic acid and protein).

Cordycepssinensis；chromatographic technique；spectroscopic technique；molecular biological technique

2015-09-25)

中医药行业科研专项(201507002)

*

李文佳，工程师，研究方向：中药资源与开发；E-mail：liwenjia@hecpharm.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.032