超氧化物歧化酶与L-精氨酸联合预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

邓　放　赵不非　马　跃　徐岩松　李　鹏　肖福斌　王宏升

(北华大学附属医院肝胆胰外科，吉林　吉林　132011)



超氧化物歧化酶与L-精氨酸联合预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

邓放赵不非马跃徐岩松李鹏肖福斌王宏升

(北华大学附属医院肝胆胰外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的观察L-精氨酸(L-Arg)和超氧化物歧化酶(SOD)两者分别应用和联合应用在大鼠肝缺血再灌注损伤(I/R)中的作用及其机制。方法将大鼠随机分为假手术组、I/R组、L-Arg预处理组(L-Arg组)、SOD预处理组(SOD组)、L-Arg和SOD联合预处理组(L-Arg+SOD组)。治疗组大鼠肝缺血前分别及联合给予L-精氨酸和SOD ,再灌注后分别分析血液丙氨酸转氨酶(ALT), 天冬氨酸转氨酶(AST)水平；切取肝脏组织测一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量；组织病理学观察肝细胞各种病理变化。结果治疗组ALT、AST活性较I/R组有所降低(P<0.05)， L-Arg+SOD组降低更明显(P<0.05)。和I/R组相比较，治疗组eNOS的表达、NO的量增加(P<0.05)，诱导型NOS(iNOS)表达增加不明显，和I/R组相比较却有所降低，MDA含量显著降低(P<0.05)，以上各项指标在各治疗组中均以L-Arg+SOD组变化更明显(P<0.05)。I/R组示肝组织破坏明显，治疗组明显改善。结论SOD与L-精氨酸均能够对大鼠肝I/R损伤具有保护作用，两者联用效果更好。

关键词〔〕一氧化氮;超氧化物歧化酶;L-精氨酸;肝缺血再灌注损伤

第一作者：邓放(1974-)，男，博士，副主任医师，主要从事腹腔镜胆道外科研究。

缺血再灌注(I/R)损伤在肝脏手术特别是肝切除和肝移植手术中是比较常见的，常伴有微循环的障碍、组织坏死、细胞死亡等情况〔1〕。在这一过程中，氧化损伤起着非常关键的作用。超氧化物歧化酶(SOD) 作为一种氧自由基清除剂能够减轻肝细胞I/R损伤,早已经在动物实验和临床实践中得到证实并广泛应用。近年研究表明，由I/R引起的肝细胞损伤，促发了一系列复杂的生化反应，这中间一氧化氮(NO)扮演着关键的角色，由其产生的三个亚型在肝脏功能中都扮演着重要的角色〔2〕。先前的研究已经证实了L-精氨酸(L-Arg,NO的前体)在NO介导路径中的作用〔3〕。本研究评价SOD和L-精氨酸同时给药对于I/R损伤模型鼠肝脏结构和肝功能指标的影响。

1材料和方法

1.1药品及试剂L-精氨酸和外源性SOD购自上海普振生物科技公司；血清天冬氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、丙氨酸转氨酶(AST)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒、NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物及分组取健康活泼的大鼠50只(由北华大学动物实验中心提供)，雌雄不限，质量200～300 g，随机分成5组，每组10只，术前12 h禁食，但可以饮水，分别为假手术组、I/R组、L-Arg预处理组(L-Arg组)、SOD预处理组(SOD组)、L-Arg和SOD联合预处理组(L-Arg+SOD组)。SOD 用0.1 mol/L EDTA溶液(pH7.8)溶解，配成4 000 U/ml的溶液。缺血前予以SOD(2 000 U/100 g)及L-Arg(40 mg/100 g)腹腔内注射给药，假手术组和I/R组腹腔内注射生理盐水(0.5 ml/100 g)。

1.3动物模型制备称重后按体重予乌拉坦(1.2 g/kg体重)腹腔注射麻醉，取上腹部正中切口，显露肝门、肝蒂，分离肝动脉、门静脉。采用Pringle氏法制备肝缺血再灌注损伤模型，用无损伤小动脉夹以0.9 N的闭合力阻断肝十二指肠韧带中的肝动脉、门静脉和胆总管，造成全肝缺血；30 min后，松开动脉夹实行再灌注3 h，肉眼见肝脏由暗红色变成鲜红，表明再灌注成功。假手术组肝动脉和门静脉暴露但不阻断。

1.4取材及观察指标在再灌注结束后，用肝素管从下腔静脉抽取5 ml血液。血液样本在室温下800 r/min离心10 min，分离出血浆用作分析丙氨酸转氨酶(ALT), 天冬氨酸转氨(AST)水平。切取肝脏组织放入-80℃冰箱保存，作为组织病理学研究和生化分析。取适量肝组织制成10%匀浆，用BCA法测总蛋白含量，硝酸还原酶法测NO含量，MDA试剂盒测MDA含量。组织病理学观察取肝组织块，经固定后，脱水、浸蜡、包埋，制作4 μm切片，行HE染色，400倍电镜视野下观察肝细胞病理变化。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和q检验。

2结果

2.1各组血清ALT、AST水平见表1。I/R组血清ALT、AST活性显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，L-Arg组和SOD组ALT、AST活性较I/R组有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)； L-Arg+SOD组血清ALT、AST活性和SOD组及L-Arg组相比较降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

组别ALTAST假手术组30.3±12.328.6±10.3I/R组370.8±102.31)360.4±96.31)SOD组200.5±76.42)187.6±66.62)L-Arg组297.3±100.32)279.8±90.62)L-Arg+SOD组111.7±40.82)3)4)101.8±32.72)3)4)

与假手术组比较：1)P<0.05；与I/R组比较:2)P<0.05；与SOD组比较:3)P<0.05；与L-Arg组比较:4)P<0.05，下表同

2.2各组肝组织NOS，NO，MDA测定的结果I/R组内皮型NOS(eNOS)的表达及NO含量和假手术组无显著差异，而治疗组eNOS的表达及NO含量显著增加(P<0.05)。相反，诱导型NOS(iNOS)表达I/R组较假手术组显著增加，治疗组却增加不明显，但和I/R组相比较却有所降低(P<0.05)。与假手术组比较，I/R组小鼠肝组织MDA含量显著升高(P<0.05)，和I/R组相比较治疗组显著降低(P<0.05)，以上各项指标在各治疗组中均以L-Arg+SOD组变化更明显(P<0.05)。见表2。

2.3各组肝脏病理组织学结果假手术组有正常的肝组织结构：肝索排列整齐，肝窦形态基本正常，无狭窄及扩张，肝细胞边界清楚、形态无异常变化。I/R组示肝组织肝索排列明显紊乱，肝窦形态不规则，窦状隙充血，部分内皮细胞脱落，有少量中性粒细胞浸润。各治疗组肝细胞结构完整，肝细胞水肿较少，肝索排列可，肝窦形态较规则，仅有少量中性粒细胞浸润及局灶的窦状隙充血(见图1)。

表2各组肝组织NOS、NO、MDA含量比较

组别eNOS(U/mgprot)iNOS(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手术组0.46±0.110.26±0.090.36±0.153.83±1.54I/R组0.51±0.150.51±0.221)0.41±0.1515.42±6.381)SOD组0.61±0.222)0.30±0.122)0.81±0.222)10.65±4.612)L-Arg组0.63±0.202)0.33±0.202)0.93±0.202)10.85±3.652)L-Arg+SOD组0.81±0.292)3)4)0.20±0.292)3)4)1.21±0.292)3)4)5.87±2.712)3)4)

图1　各组肝组织病理改变(HE，×400)

3讨论

肝脏移植、肝部分切除手术、处理严重的肝脏外伤时，都需要暂时性阻断肝血流，重新恢复血液供应后，可造成肝的缺血再灌注损伤。再灌注损伤是致手术后肝脏功能衰竭的重要原因之一。其病理生理过程复杂，迄今尚无明确认识，故对其发生机制的研究已成为医学界关注的热点，如何减轻肝I/R损伤亦是目前肝脏外科特别是肝移植外科的研究热点之一〔4〕。

氧化应激损伤在包括器官移植在内的I/R损伤中扮演重要的作用。缺血导致肝细胞出现快速的生化、结构的改变，进而引起肝细胞功能变化。I/R损伤在主要器官促发一系列反应。这些反应通过细胞因子和炎性介质的释放引出一系统炎症反应(肿瘤坏死因子-α，白细胞介素6，血小板活性因子，白三烯和NO)并引起随后的氧化应激〔5，6〕。

在这方面，几个研究已经说明I/R损伤是和蛋白质氧化修饰、线粒体损伤、脂质过氧化作用有着密切联系的。这种变化是一种自动催化机制，它导致了细胞膜的破坏损伤。进而导致毒素的产生、活性代谢产物和细胞的死亡。目前没有方法用于治疗肝脏的I/R损伤，只有通过预防才能够减少或消除损伤的发生。

脂质过氧化，作为一个独立的损害因素，已经被认为和I/R损伤密切相关，MDA水平可以代表脂质过氧化率的一个很好的指标。和先前的结果相一致，我们的研究结果证实肝脏组织中的MDA水平在I/R后显著增加。我们的结果也证实L-Arg和SOD可引起MDA水平的显著降低，这些药物可以引起保护性的反应，并起到部分净化剂的作用〔7〕。

在肝脏I/R损伤中，肝实质损伤之前微循环紊乱是一个重要的因素。血管收缩物质和血管舒张因子的不平衡导致了早期微循环的紊乱，NO、内皮素 (ET)等起着重要作用。NO合酶(NOS)在体内有3种异构体:神经型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和诱生型(iNOS)，iNOS 存在于激活的巨噬细胞和各型细胞，为非钙和钙调素依赖性的，生成的NO具有细胞毒作用，参与介导免疫反应〔8〕。最新的证据表明iNOS是很多的细胞因子如肿瘤坏死因子α的促发因素，它产生大量的NO，在肝脏的病理生理学中还存有很多的争议〔9〕。由eNOS产生的适度水平的NO有较好的血管扩张的活性，而由iNOS产生的高水平的NO与超氧阴离子相互作用能够产生过氧亚硝酸盐阴离子，是导致肝脏氧化病理条件的潜在氧化物质。此外，由iNOS产生的NO能够诱导白细胞黏附、炎性细胞渗入和实质细胞功能障碍。iNOS的过表达和多种慢性疾病有关。

在我们的研究中，我们观测到iNOS表达I/R组较假手术组有显著的增加，而治疗组能够减弱这种增加。在eNOS I/R组较假手术组没有显著的不同，而治疗组和I/R组相比确有显著的增加。以上变化均以L-Arg+SOD组最为显著。本研究还发现在肝I/R损伤模型中，肝组织中的NO含量比假手术组略升高，可能为代偿结果，而应用L-Arg和SOD干预后，肝组织NO含量比I/R对照组明显增高。eNOS与NO变化具有一致性。通过eNOS活性上调、iNOS活性降低、MDA含量减少，可推测L-Arg和SOD联合应用可能一方面通过适度影响血管内皮细胞的功能，舒张血管改善微循环; 另一方面抑制局部炎症反应，减轻氧自由基的损伤作用。

谷胱甘肽在氧化损伤中通过参与细胞防御系统对抗氧化损伤提供主要的保护作用。研究显示各种刺激诱导的组织损伤和谷胱甘肽的缺乏有关，高水平的谷胱甘肽水平是减少氧化损伤起到很大的作用〔10〕。但是，在I/R损伤过程中的谷胱甘肽水平的减少是由于在氧化应激中的大量消耗。血浆中肝脏大量酶的释放也证实了再灌注伴随着酶释放的组织损伤。然而，在I/R损伤之后，血浆中的AST和ALT水平通过治疗显著减少，说明两种药物的联合应用具有较好的减少损伤的作用。另外两种药物的保护性作用通过组织学发现被证实，治疗后的肝叶组织保持着原有的肝脏结构，只有局部的充血和点状坏死。

综上所述，使用L-Arg和SOD干预后，I/R大鼠肝脏损伤减轻，可能是通过改善肝脏I/R后的微循环紊乱，减轻氧自由基对细胞的损伤所致。可以建议L-Arg和SOD能够成为潜在的治疗成分来对抗I/R诱导的氧化损伤。

参考文献4

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9Constantinos Nastos, Konstantinos Kalimeris, Nikolaos Papoutsidakis,etal.Global consequences of liver ischemia/reperfusion injury〔J〕. Oxid Med Cell Longev，2014;2014: 906-65.

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〔2015-09-17修回〕

(编辑曹梦园)

通讯作者：王宏升(1966-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事肝胆系统肿瘤研究。

基金项目：吉林市科学技术局基金项目(No.201233125)

中图分类号〔〕R654. 1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6710-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.028