1型糖尿病大鼠心肌纤维化中微血管内皮细胞间质转分化的鉴定

黄　俊　张明霞　黄江燕　万　欢

(南昌大学第一附属医院心内科，江西　南昌　330006)



1型糖尿病大鼠心肌纤维化中微血管内皮细胞间质转分化的鉴定

黄俊张明霞1黄江燕万欢

(南昌大学第一附属医院心内科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的鉴定链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠心肌纤维化中是否发生了心肌微血管内皮细胞-间质转分化。方法STZ诱导大鼠心肌纤维化，12 w超声心动图检测大鼠心功能指标，VG染色观察心肌组织胶原含量变化，免疫组化鉴定心肌组织中微血管内皮细胞间质转分化。结果心脏超声提示实验组大鼠左室前后壁厚度(LVWT)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)明显大于对照组，左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(FS)明显小于对照组(P<0.05)。心肌VG染色实验组粉红色胶原组织增多，而对照组仅有少许红色胶原组织表达。心肌免疫组化染色观察，实验组与对照组CD31、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)均表达阳性，但实验组CD31表达减弱(P<0.05)、微血管壁α-SMA表达增强(P<0.05)。免疫酶双染技术检测，对照组微血管内皮被染为棕黄色，实验组微血管内皮红色染色较强，而棕黄色较弱。结论STZ诱导的1型糖尿病大鼠心肌纤维化过程中发生了心肌微血管内皮细胞-间质转分化。

关键词〔〕糖尿病；内皮细胞；间质转分化

1杭州市萧山区第二医院内科

第一作者：黄俊(1968-)，男，医学博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事冠心病防治及介入治疗研究。

糖尿病心肌纤维化在糖尿病心肌病、心力衰竭的发生发展中起着重要作用。成纤维细胞过度增殖活化、细胞外基质大量产生过度沉积是心肌纤维化的主要原因。针对成纤维细胞的来源，源头控制纤维化的发生发展，开始引起人们的兴趣。研究发现微血管内皮细胞-间质转分化(EndMT)途径可生成大量的成纤维细胞、肌纤维母细胞〔1，2〕。本研究拟建立1型糖尿病大鼠心肌纤维化模型，鉴定其中是否发生了EndMT现象。

1材料与方法

1.1材料30只雄性SD大鼠，体质量(170±5.85)g，随机分为实验组和对照组，每组15只。实验动物按照南昌大学医学院动物伦理委员会规定执行。链脲佐菌素(STZ)；血糖仪(强生稳豪)；GE VIVI7超声诊断系统(探头频率12 MHz，美国)；α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、CD31抗体(博士德)；免疫组化Elivision plus试剂盒(福州脉新生物)；Polymer双染检测试剂盒(北京中杉金桥生物)。

1.2方法

1.2.1建立大鼠糖尿病心肌纤维化模型实验组大鼠单次腹腔注射STZ(60 mg/kg)制作1型糖尿病心肌纤维化模型。对照组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。STZ注射后72 h，尾静脉采血测随机血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L大鼠。每周测大鼠体质量、血糖1次，血糖≥16.7 mmol/L即认为模型建立成功。

1.2.2心脏功能检测建模后12 w超声心动图检测。大鼠麻醉固定仰卧略向左倾斜位后获取胸骨旁左室长轴切面二维及M型超声图像，测量左心室射血分数(LVEF)，左室前、后壁厚度(LVWT)，左室舒张末期内径(LVEDD)，左室收缩末期内径(LVESD)和左心室短轴缩短率(FS)。

1.2.3心肌VG染色组织学检查麻醉、处死大鼠，取左心室心肌组织，10%PBS中性甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋后制成切片，VG染色观察心肌组织胶原含量变化，Image-Pro Plus 4.0图像分析系统测量心肌组织胶原容积分数(CVF)=胶原面积/总面积。

1.2.4免疫酶组化鉴定EndMTElivison二步法：切片按免疫组化常规处理，微波法修复抗原，分别加入小鼠来源的α-SMA一抗和兔来源的CD31一抗，并设阴性对照，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物；显色，苏木素衬染，脱水、透明、封片。显微镜观察并拍照。Polymer双染检测：切片脱蜡和水化方法同Elivison二步法，微波法修复抗原，加入足量的两种一抗混合物(小鼠来源的α-SMA一抗和兔来源的CD31一抗)于切片上，同时设阴性对照，每张切片加入50～100 μl 混合二抗，镜下观察显色情况，苏木素复染，自来水冲洗，放入PBS中返蓝，滴加封片剂。显微镜观察并拍照。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1两组大鼠生存率、血糖、心脏功能及心肌组织学改变实验组与对照组大鼠生存率分别为93.3%和100%；实验组大鼠血糖均>16.7 mmol/L，对照组在5.6～7.4 mmol/L。超声检测实验组大鼠LVWT、LVEDD和LVESD明显大于对照组；LVEF和左心室FS明显小于对照组(P<0.05)(表1)。心肌VG染色实验组粉红色胶原组织增多，对照组黄色心肌组织内仅有少许粉红色胶原组织表达；胶原半定量分析：对照组CVF(1.93±0.45)%明显少于实验组CVF〔(8.35±1.02)%，P<0.05〕。

2.2Elivison二步法结果比较光学显微镜观察封片，Image-Pro Plus 4.0图像分析系统计算机读片，以阳性染色区域的积分光密度值做半定量分析。实验组与对照组CD31均表达阳性，但实验组CD31表达减弱(P<0.05)。实验组与对照组α-SMA均表达阳性，但实验组心肌组织微血管壁α-SMA表达增强(P<0.05)(表2)，提示实验组中微血管内皮细胞性质已向间质样细胞转化。

组别LVEF(%)LVWT(cm)LVEDD(cm)LVESD(cm)左心室FS(%)对照组87±2.30.15±0.010.55±0.020.25±0.0155±1.78实验组63±2.21)0.20±0.011)0.69±0.021)0.45±0.021)32±1.321)

与对照组比较：1)P<0.05，下表同

组别α-SMACD31对照组3.2137±0.15262.3264±0.2769实验组8.2256±0.14361)1.4384±0.17981)

2.3Polymer双染检测结果对照组微血管内皮被染为棕黄色，而实验组微血管内皮红色染色较强，黄色染色较弱(图1)。提示实验组中微血管内皮细胞已发生间质转分化。

图1　光学显微镜观察各组大鼠心肌细胞横切面Polymer双染色(×40)

3讨论

糖尿病心肌纤维化是糖尿病严重并发症之一，在糖尿病心肌病、心力衰竭的发生发展中起着重要作用。心肌成纤维细胞占心肌细胞总数的60%～70%，病理条件下由自身增殖及骨髓来源而过度增殖活化，过度产生细胞外基质在心肌纤维化中发挥作用〔3〕。近来发现成纤维细胞除上述来源，EndMT途径也生成大量的成纤维细胞、肌纤维母细胞〔1〕。

EndMT是由于炎症因子、机械损伤、缺氧等刺激微血管内皮细胞，使细胞间紧密连接破坏，丧失黏附特性从基底膜脱落，胞质内细胞骨架重排，表达α-SMA、成纤维细胞特异蛋白-1等表型蛋白，胞质内肌丝从上皮型的角蛋白转变为间质细胞的波形蛋白，细胞形态由卵石状变成梭形，类似成纤维细胞、肌纤维母细胞，并具备相应的功能，在组织器官的纤维化进程中发挥作用〔4〕。Zeisberg等〔5〕用STZ诱导的小鼠糖尿病肾病模型中，几乎30%～50%的成纤维细胞同时表达内皮细胞标志CD31和成纤维细胞、肌成纤维细胞标志人纤维母细胞素面抗原(FSP)-1、α-SMA，提示某些病理情况下EndMT来源的成纤维细胞占到了某些组织器官成纤维细胞总数的1/3～1/2。

本实验提示实验组内皮细胞性质样细胞减少，微血管内皮细胞已向成纤维样细胞转化。Polymer双染检测试剂盒检测发现，对照组微血管内皮被染为棕黄色，而实验组微血管内皮红色染色较强，黄色染色较弱，进一步表明对照组微血管内皮细胞未发生间质转分化；而实验组中微血管内皮细胞已发生间质转分化，说明在STZ诱导的1型糖尿病大鼠心肌纤维化中，EndMT现象也同样存在。而通过EndMT途径生成的成纤维细胞在细胞外基质代谢中的作用有待于进一步研究。

参考文献4

1Iwano M,Plieth D,Danoff TM,etal.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis〔J〕.J Clin Invest,2002；110(3)：341-50.

2Zeisberg EM，Tarnavski O，Zeisberg M，etal.Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis〔J〕.Nat Med,2007；13(8)：952-61.

3Krenning G，Zeisberg EM，Kalluri R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis〔J〕.J Cell Physiol,2010；225(3)：631-7.

4Willis BC，duBois RM，Borok Z.Epithelial origin of myfibroblasts during fibrosis in the lung〔J〕.Proc Am Thorac Soc,2006;3(4)：377-82.

5Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，etal.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial to mesenchymal transition〔J〕.J Am Soc Nephrol,2008；19(12)：2282-7.

〔2014-07-20修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：江西省自然科学基金(20132BAB205034)；江西省教育厅资助项目(GJJ12059)

中图分类号〔〕R587〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6653-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.005