孵化后期死鸡胚沙门氏杆菌的分离与鉴定

李遵瑞 （山东省临沂市兰山区畜牧兽医局半程畜牧兽医站 276036）

孵化后期死鸡胚沙门氏杆菌的分离与鉴定

李遵瑞 （山东省临沂市兰山区畜牧兽医局半程畜牧兽医站 276036）

为确诊某肉鸡孵化场死亡鸡胚的致病原因，对孵化后期死亡的20枚鸡胚进行流行病学调查、细菌分离培养，通过生化试验、运动性试验、动物致病性试验等鉴定方法对病原进行鉴定，并对分离菌进行药物敏感性试验；20枚死亡鸡胚中有8枚带菌，带菌率40%，其中3株为沙门氏菌，沙门氏菌带菌率为15%。分离菌对头孢噻呋钠和左旋氧氟沙星、四环素高敏，对盐酸黄连素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、青霉素、硫酸庆大霉素中敏，对阿奇霉素、磷霉素钙、恩诺沙星、链霉素产生了耐药性。

肉鸡；孵化场；死胚；沙门氏菌；分离鉴定

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

临沂大通孵化场孵化后期死亡鸡胚20枚。

1.1.2 培养基及试剂

普通肉汤培养基、普通营养琼脂 （购自青岛高科园海博技术有限公司）、半固体动力培养基、伊红美蓝琼脂、麦康凯琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂 （购自北京陆桥技术有限责任公司）、SS琼脂 （购自北京中海生物科技有限公司）、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等细菌生化常规微量鉴定管（购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所），快速革兰氏染色液试剂盒 （购自济南百博生物技术股份有限公司）。

1.1.3 药敏试验纸片

药敏试纸片 （杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.1.4 试验动物

10日龄鸡胚10枚，2日龄雏鸡10只，小鼠10只，均由临沂大学动物预防医学实验室提供。

1.2 试验仪器

SW-WJ-LCU洁净工作台、油镜、立式压力蒸汽灭菌器、生化培养箱、孵化出雏机、电子天平、可调万用电炉等。

2 试验方法

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 各种培养基的制备

2.1.1.1 普通营养琼脂

称取普通营养琼脂粉33.0g加入1L蒸馏水中，加热煮沸到完全溶解后用立式压力蒸汽灭菌器设定为121℃高压灭菌20min，冷却至46℃左右时制成斜面备用。

2.1.1.2 伊红美蓝琼脂 （EMB）

称取EMB37.5g加入1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后用立式压力蒸汽灭菌器设定为121℃高压灭菌20min，冷却至55℃左右倾注平板备用[1]。

2.1.1.3 麦康凯琼脂

称取麦康凯琼脂粉54.0g，加入1L蒸馏水中，加热煮沸完全溶解后，用立式压力蒸汽灭菌器设定121℃高压灭菌20min。

2.1.1.4 SS琼脂

称取SS琼脂粉60.0g加入1L蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，用立式压力蒸汽灭菌器设定121℃高压灭菌20min。冷却至55℃倾注灭菌平板备用。

2.1.1.5 半固体动力培养基

称取22.0g加入1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，用立式压力蒸汽灭菌器设定121℃高压灭菌20min，备用。

2.1.1.6 胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA）

称取TSA38.0g加入1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，用立式压力蒸汽灭菌器设定121℃高压灭菌20min，备用。

2.1.1.7 普通肉汤培养基

称取30.0g，加热溶解加入1000ml蒸馏水中，并不停搅拌，煮沸1min，分装三角烧瓶，灭菌锅121℃高压灭菌20min，备用。

2.1.2 涂片及染色

将可疑菌落进行革兰氏染色[2]，镜检。首先用酒精灯灭菌的接种环挑取菌落均匀涂布于洁净玻片上，自然干燥后火焰固定，以微烫手背的温度为标准。待冷却后加结晶紫溶液进行初染1min，之后水洗，甩干。再加革兰氏碘溶液进行媒染1min，之后水洗，甩干。用95%酒精脱色20～30s，之后水洗，甩干。最后用沙黄溶液复染30s之后水洗，用滤纸把水分吸干，镜检观察染色的形态与特征。

2.1.3 分离培养与观察

在超净工作台上，以常规无菌操作用接种环挑取鸡胚组织，分别接种于普通琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、SS培养基。于37℃下培养24h后，挑取不同形态特征的菌落进行培养，做进一步鉴定。

2.1.4 运动性观察

用灭菌的接种针取培养物垂直穿刺接种于半固体培养基中央，放培养箱中培养24h后观察。

2.1.5 生化试验

用灭菌的接种针将前面所分离出的细菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等的糖发酵管及MR、VP、枸橼酸盐、氧化酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐、尿素等生化试验管。然后放入生化培养箱中培养24h后观察结果。

2.2 动物致病性试验

2.2.1 鸡胚接种

将分离出的细菌接种于普通营养肉汤中，在37℃下培养24h，之后取提供的10日龄鸡胚，其中5个用于接种试验，另外5个作为对照试验。试验组鸡胚尿囊腔注射接种2ml，另一个鸡胚注射等量的生理盐水作对照试验[3]。

接种方法：①用照蛋器找到气室，用记号笔标记出气室边缘，酒精棉消毒鸡胚表面后，用大针头打孔；②以2ml/枚的量垂直注入尿囊腔；③注射完后，用蜡封住打的孔。然后放入孵化箱内继续孵化，并观察记录鸡胚的死亡情况。

2.2.2 雏鸡接种

将分离出的细菌接种于普通营养肉汤中，在37℃下培养24h，取实验室提供的10只雏鸡，其中5只作为试验组，另外5只作为对照组。然后以2ml/只的量注射到试验雏鸡的腹腔中。注射完后，拔出针头，用棉球按压，防止外溢造成污染。

2.2.3 小鼠接种

将分离出的细菌接种于普通营养肉汤中，在37℃下培养24h，取实验室提供的10只小鼠，其中5只用于接种试验，另外5只用于对照试验。对试验组小鼠腹腔注射2ml，对照组注射等量的生理盐水。然后给小鼠充足的饮水、饲料，在同一环境下喂养，进行观察和记录。

2.3 药敏试验

将接种环置于酒精灯火焰上方进行灭菌，待接种环冷却后挑取分离培养的细菌涂在营养培养基上，稍干后，将镊子火焰高温消毒后，夹起各种抗生素药敏纸片贴于培养基表面，注意要完全接触。药敏制片要均匀的分布于培养基中，防止抑菌圈重叠，各药敏制片的中心距离要大于24mm。记录药敏制片的名称和位置，在15min后，将培养基放入培养箱中，37℃培养24h后，进行观察并测定抑菌圈的直径。然后根据抑菌圈直径的大小来判断该菌对各种药物的敏感性。

判定标准：没有抑菌圈为不敏感，抑菌圈直径10mm以下则为低度敏感；直径在10～15mm范围内为中度敏感；抑菌圈的直径在15mm以上为高度敏感[4]。

3 试验结果及分析

3.1 涂片染色结果

将涂片染色后的细菌进行镜检，视野中发现有大量红色、革兰氏阴性、短粗、两端钝圆的小杆状菌，呈单个、成对或成丛分布，无芽胞，无荚膜。

3.2 分离培养结果

该菌在SS琼脂平板培养基上生长为无色半透明菌落，一部分菌落中间有黑色；在麦康凯培养基上观察菌落为无色透明湿润、圆形凸起、周边不整齐；在普通琼脂平板上菌落为圆形隆起、无色半透明、光滑。该菌在肉汤中培养24h后观察，混浊，放置后有沉淀，震荡试管，有絮状物升起。其培养特性与沙门氏菌相同。

从被检死亡鸡胚的卵黄囊细菌检出情况为：20枚鸡胚中有10枚分离出细菌，带菌率为50%，其中沙门氏菌有3株，带菌率6.67%。

3.3 运动性观察结果

人工培养后用灭菌的接种针取单一菌落垂直接种于半固体培养基，将其放入生化培养箱中37℃培养24h后，观察半固体培养基呈云雾状。

3.4 生化试验结果

在生化培养基中接种营养培养基上的沙门氏菌，将细菌生化常规微量鉴定管倒置放入生化培养箱，37℃培养24h后。观察结果枸橼酸盐试验为阳性，VP试验为阴性，尿素分解试验为阴性。硝酸盐还原试验阳性。分解葡萄糖、甘露醇产酸产气，分解麦芽糖、山梨醇产酸不产气，不分解蔗糖、半乳糖。根据以上结果，确定该致病菌生化试验结果与沙门氏菌相同。

3.5 鸡胚接种结果

经尿囊腔接种的鸡胚试验组37h内全部死亡，对照组均健活。剖检死亡的鸡胚发现其卵黄吸收不良，卵黄囊有炎症，并且有黄绿色干酪样物质；肝脏充血淤血肿大；十二指肠内有干酪样物质。

3.6 雏鸡接种结果

腹腔接种5只试验组雏鸡表现为精神萎靡，食欲不振，卧地不起，病程长的有严重的脱水。剖检后可以发现死亡雏鸡肝肿大，表面有散在的出血点。消化道也有出血，呈点状、带状，尤其是十二指肠，呈弥漫性出血。部分死亡鸡只盲肠内有灰白色的干酪物堵塞。在肝、脾、肺等处均能回收到该菌。对照组均健活。

3.7 小鼠接种结果

试验组小鼠3日内全部死亡对照组均健活。

3.8 药敏试验结果

根据判断标准，分离菌对头孢噻呋钠和左旋氧氟沙星、四环素高敏，对盐酸黄连素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、青霉素、硫酸庆大霉素中敏，对阿奇霉素、磷霉素钙、恩诺沙星、链霉素产生了耐药性。

4 讨论

（1）通过流行病学调查、临床症状、病理剖检、病原的分离与鉴定及致病性试验，确定死亡鸡胚中病原为沙门氏菌。

（2）其中共20份死胚中，8份检出了病原菌，带菌率为40%。其中沙门氏菌3株，带菌率15%。说明该孵化场孵化的雏鸡沙门氏菌感染率较高，应及早应用抗菌药物预防。

（3）沙门氏菌既可以水平传播，也可垂直传播。垂直传播有两种情况：一种是经卵巢直接进入卵内，另一种是经过各种途径污染蛋壳后进入卵内。细菌通常在低温时不能或很少通过蛋壳，但是随着温度的升高，则很容易通过蛋壳后而进入蛋内。先在蛋黄内增值，在孵化过程中便侵入胎儿体内。该鸡胚沙门氏菌的感染，也可能是同时由两种传播途径造成的可能性，确诊有待于进一步调查研究[5]。

（4）沙门氏菌复杂多样，在公共卫生学上普遍受到重视。因此，无论是种蛋还是商品蛋，都应对其进行消毒灭菌处理，防止引起沙门氏菌病。在种蛋上孵前，要对种蛋进行消毒灭菌，防止种蛋在孵化过程中由于沙门氏菌的侵入而导致鸡胚死亡。

[1]张正庆,罗薇,刘亚刚,等.禽源致病性沙门氏菌四环素耐药性基因tetC的PCR扩增及序列分析[J].畜禽业,2006,（24）:18-20.

[2]陈飞,成大荣,王丽芳,孙怀昌,张鑫宇,等.禽沙门氏菌毒力岛标志基因研究与mgtC基因序列分析[J].江苏农业科学,2010（6）:12-13.

[3]仇莉,缪晓斌,贲巧云,韩书英,沈永华,等.江苏东台地区鸡白痢沙门氏菌的耐药性分析[J].兽医导刊,2009（4）:23-25.

[4] 潘志明,焦新安,刘文博,高崧,倪振亚,张扬,刘学贤,张如宽,刘秀梵,等.鸡白痢沙门氏菌耐药性的监测研究[J].畜牧兽医学报,2002（4）:56-57.

[5]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].第2版.北京：中国农业出版社，2002.