角蛋白网络修饰导致毛囊纤维的机械性硬化

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角蛋白网络修饰导致毛囊纤维的机械性硬化

生物组织是具有显著机械特性和弹性模量结构的复合材料，其范围从几帕斯卡到几千兆帕斯卡。有一个研究领域一直致力于从分子水平到细胞和组织水平上了解生物网络的局部结构和机械特性是如何界定其宏观结构的。该研究的一种挑战是，这些网络的特性必定在长度和力度水平上数倍超越从整个组织水平转换至细胞和分子水平（反之亦然）而来的宏观机械力。

在细胞水平上，过去数十年见证了由角蛋白、微管和中间丝（IFs）组成的细胞骨架在如何决定细胞机械特性方面的长足进展。对分离细胞的体外研究和在可控性架构和组成的基础上对生物网络的体外重组，提高人们对细胞骨架结构方面的认识。然而，这些模型仍然只是近似于大多数组织复杂的三维结构。在组织水平上，结构各向异性以及各种机械性能不同的成分通常会阻碍网络结构与机械特性之间的直接相关性。分析模型和计算机模拟可从理论上将网络的宏观机械特性与局部网络结构的参数连接起来。

在此使用的人体毛囊，展示了三维组织中局部、微观网络结构如何与局部机械特性相连接的一种模型系统。毛囊的硬度预计可呈数量级倍数的增强，这是由柔软角质形成细胞分化而来的毛发纤维，其杨氏模量在千兆帕斯卡范围内。在两个极端之间，中间丝网络的角化过程使各向同性的细胞基质转变为惰性且各向异性的物质，连接了从亚细胞水平到组织水平的长度和力度。这种转变与其他角化结构（如甲和角）的形成以及角质层（皮肤的最外侧结构）的形成具有相似性。其伴随着多种生物学过程，如不同角蛋白和角蛋白关联蛋白（KAPs）的特异性表达，连同角蛋白网络的重组和水分丢失一起，导致纤维的压缩和硬化。然而，尽管一些补充研究对伴随的角化过程的网络结构的变化进行了分析，但是对其机械性硬化的结果仍了解甚少。

为此，该研究使用原子力显微镜（AFM）沿着毛囊的轴线测量角蛋白结构的硬化，并同时定量局部角蛋白网络结构和角蛋白超分子结构。

一、材料和方法

详见原文。

二、结果

毛囊机械力：对取自健康白种人完整毛囊的角蛋白网络的硬化进行定量。通过冷冻切片获得纵切面为10 μm厚度的样本，并将其吸附于载玻片上。为了模拟在体环境，必须保持高含量的水分以避免组织干燥和萎缩。因此，样本切开后立即将切片浸没于PBS溶液中。AFM检查其具有半径为纳米范围（r=20～60 nm）的尖端，因此可以对浸没切片的机械特性进行局部探查。该研究采用了力-容积模式，在10 μm×10 μm区域内通过256等距曲线法记录力和压痕深度。使用Hertz模型计算相关弹性系数。注意，确定的绝对系数值取决于顶端的形状和所用的拟合模型；尖端更适于探查深层纤维网络的局部结构。沿毛囊轴线记录推算的弹性系数。一个10 μm×10 μm区域内系数的离散度大是由样品纳米水平的不均一所致，提示所记录的力压痕曲线均值是局部毛囊机械力的代表性测量值

角化过程中网络结构变化：为了理解所观察到的毛囊的宏观硬化如何对应其角蛋白网络结构中的微观变化，我们沿着毛囊的轴线记录其纵切面的形貌学图像（topographic image）。不同于透射电镜（TEM）对超薄切片或染色的要求，AFM能够直接记录高分辨率的图像。该图像是使用AFM的峰值力定量纳米结构图（QNM）模式获得保留纤维网络结构的干燥毛囊的形貌学图。超过170 μm，网络结构随角化进程而发生变化：纤维变得更粗更直且结构更紧密。TEM研究结果与此一致。

半胱氨酸交联和（超）分子结构对网络机械性的影响：生物网络的机械特性不仅由其几何因素和纤维密度所决定，还取决于单个纤维的硬度。在距毛囊球部500 μm的硬度曲线拐点κ之上，纤维直径和方向性的微观网络改变减慢。为了更好地了解在拐点κ之后仍然出现的弹性模量的显著增加，该研究使用X射线微衍射对大纤丝（macrofibrils）的分子结构进行分析。如上所述，分析了两个毛囊间小角度和大角度X射线衍射（SAXS/WAXS）图，并得出4个不同角质化区的大致位置。比较同一供体毛囊的结构图显示，Ⅰ区包含无方向性、无定形结构，其发生5倍硬化。Ⅱ区和Ⅲ区显示为IF形成、定向，之后缩合成网络，分别对应10倍增加的弹性模量。Ⅳ区出现极少的硬化，对应IFs在大纤丝之内的最后轴向重排。在分化毛发内的角蛋白纤维含有大量的半胱氨酸残基。其与富含半胱氨酸的KAPs一起确保了IFs的共价交联。X射线衍射证实了晚期毛囊内这种逐渐形成的角蛋白-KAPs二硫化物网络的存在。这些结果表明，半胱氨酸形成和最终的轴向重排与其结构的干燥共同导致了最终的硬化。

为了验证半胱氨酸交联对网络结构稳定性的影响，在DTT还原反应前、后分别探查毛囊的结构。DTT是一种可以破坏半胱氨酸-二硫键的还原剂，AFM形貌图像证实其可以造成大纤丝的膨胀。结果显示添加DTT并不影响毛囊球部弹性模量的检测。相反，DTT可以软化分化毛发内的网络结构。同一个体内DTT处理前、后的系数比率显示，半胱氨酸交联对沿毛囊轴向的弹性模量的影响呈持续增加。

三、讨论

该研究首次对毛囊内整个角质化进程中毛发纤维的渐进性硬化进行检测，并从机械测量的角度分析微观网络结构、局部角蛋白的超分子结构和生物学事件所伴随发生的变化。

该研究的AFM和TEM数据显示，各向同性的中间丝（IF）网络出现在真皮乳头的上方，位于距毛囊基底部200 μm的伸长区（Ⅰ区）内。所观察到的IF网络的外观与之前关于角蛋白如K35和K85形成的报告一致，Ⅰ区早期内的高甘氨酸-酪氨酸和高硫KAPs且恰好位于真皮乳头处。DTT还原实验显示，半胱氨酸交联在这一阶段对其机械特性无显著的促进作用，进而推测早期KAPs与角蛋白之间的异构肽（γ-谷酰基-∈-赖氨酸）键使这种早期网络结构相当稳定，并通过之前确定的转谷氨酰胺酶3在毛囊基底部的表达和活化发挥作用。

该研究发现，从Ⅰ区开始到Ⅲ区的末端（距毛球部800 μm），其网络结构遵循幂次定律呈连续的机械硬化。在Ⅰ区和Ⅱ区，小的大纤丝呈横向聚集，导致其直径逐渐增大进而使IFs形成网络。而且还出现大纤丝所占容积率的逐渐增加，同时伴有AFM观察到的微观网络的渐进性定向和X射线衍射确定的超螺旋角蛋白圈的渐增性极化。总之，这些结果显示，要形成成熟毛发的很大一部分蛋白质在Ⅱ区末端被合成大纤丝，通常受调于转谷氨酰胺酶为基础的网络，这与从Ⅲ区向前所表达的角蛋白类型缺乏进一步改变的结果一致。该研究能够通过使用一种各向同性半柔性交联三维网络模型（非仿射纤维弯曲是主要的弹性机制）从理论上模拟Ⅰ区和Ⅱ区内的相关机械性硬化。在这种非热能的网络中，网络的筛孔尺寸必须小于纤维持续长度，后者可以从Ⅰ区和Ⅱ区内的大纤丝结构加以推断。这些非热能模型通常是纤维组织如胶原，不同于其他用于描述肌动蛋白网络的模型。

大纤丝的直径在Ⅱ区后段（500 μm处）达到最大值，而机械性硬化仍在持续增强。因此上述模型不能解释这种持久性硬化，提示有其他附加的因素使其变硬，如渐增的网络向性及密实性，以及二硫化物交联所致大纤丝内在的机械强化。大纤丝的内在强化可能由KAPs（尤其是超高含硫家族）的连续合成所驱动，如同原位杂交研究中所示直至Ⅱ区后段，提示KAPs不断的融入大纤丝中。与之相符，X射线衍射实验显示了在500～700 μm之后，Ⅲ区内KAP/IF类六边形网络的逐渐出现和IF内部结构的最后成熟。DTT还原实验证实二硫键对整体网络结构的重要作用在Ⅱ区内已经显现。然而，因为大多数KAP/IF二硫键的构成远离毛囊（在Ⅳ区内，最早650 μm），所以距离基质结构的完成还很远。因此，这些早期二硫化物主要代表了IF内的二硫化物，其促进了大纤丝的整体机械性能。似乎这种IF内二硫化物的形成构成了导致毛囊该区域内IF成熟的驱动力。这一结果与某些研究者的近期工作相符，后者提出Ⅲ区内IFs的成熟应该有IF内半个半胱氨酸基团相伴，从而能够完成这种交联。

该研究发现，在IV区内（始于800 μm），毛发纤维的弹性模量仅为轻度增加（系数为2）。对于浸没于PBS内的毛囊来说，机械性成熟的完成从1 000 μm处至球部上方。这与紧密压缩的纤维结构共同提示向延伸为主的网络结构的转变。与之相反，Ⅰ区和Ⅱ区的网络结构以弯曲为主。然而，DTT在1 500 μm处对毛囊机械力的影响是800 μm处的两倍，证实在网络结构中的进一步变化。X射线微衍射结果显示，KAP/IF二硫化物网络的形成是发生在800 μm以上仅有的结构重排。KAP/IF二硫化物网络对毛囊机械力的这种低影响力，尽管其密度超高，很可能是实验过程中PBS浸没的结果。由于KAP基质的吸湿特性使其在水中会膨胀，而IFs的吸水量极少，从而导致离子与H键之间的相互作用减弱。这种膨胀能够使所测量的基质的机械作用减至最小。KAP/IF二硫化物网络的最后重排与水分的丢失最终确定了毛囊纤维的角化进程。

四、结论

该研究在组织水平上将角蛋白大纤丝结构和分子结构的变化与局部机械性能联系在一起。复杂的同步变化（包括大纤丝增厚、纤维定向排列和角质化进程）导致毛发纤维的硬度在短短1 mm内增加了3个数量级。该研究结果与现存的关于毛囊结构和生物学的文献完全相符，同时与相关结构和机械性能的理论模型兼容。该研究还进一步证实了一种异构肽网络架构可使早期角蛋白大纤丝稳定的假设，并提出此后的一系列二硫化物网络形成事件。

［陈旭孔佩慧摘自Bornschloql T,Bildstein L,Thibaut S,et al.Keratin network modifications lead to the mechanical stiffening of the hair follicle fiber［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113（21）:5940⁃5945.DOI:10.1073/pnas.1520302113.］