RNA干扰的系统生物学研究进展

张 清，石张镇，许 人，王世宝，姜 娜，王 晶，郭艳茹，孙延霞*

(1.吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院二部 呼吸科)



RNA干扰的系统生物学研究进展

张 清1，石张镇1，许 人2，王世宝1，姜 娜1，王 晶1，郭艳茹1，孙延霞1*

(1.吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院二部 呼吸科)

RNA干扰(RNAi)，又名RNA沉默，是指由双链DNA(dsRNA)引起的特异性基因抑制现象。目前，RNAi已经成为了一种非常强大的实验方法，用于大规模的基础和临床研究。虽然体外RNAi效果很好，但它在应用于体内仍有挑战性，这也是临床应用RNAi技术的难点。系统生物学是一个试图整合不同层次信息以理解生物系统如何行使功能的学术领域。RNAi的系统生物学研究内容主要包括：研究参与RNAi过程的组分，探索各不同组分之间的相互关系和相互作用，建立整个RNAi系统的可理解模型与仿真，用来指导合理的设计实验和临床上应用RNAi为基础的治疗。

RNAi的动力学研究是RNAi系统生物学研究的重要部分。对RNAi动力学的深入研究是临床应用RNAi的基础，尤其确定取得临床疗效所需的给药方案将是成功应用RNAi的重要部分。目前研究体内RNAi需要高成本投入，全面探索RNAi的过程，正确理解影响RNAi的动力学参数，可以专门定制和优化用于科研与临床的方案，从而节省大量的时间和资源。数学建模使用简单的动力学方程反映RNAi过程中的每一步，可以揭示许多有关RNAi动力学方面的问题。部分研究者在这方面做了一些工作，也给我们带来了更深的思考。以下就对于在研究RNAi系统生物学过程中的几个关键问题进行分别阐述。

1 RNAi的机制

RNAi广泛存在于真核细胞生物体中。1998年，美国科学家Fire和Mellow发现了RNAi的机制。细胞内异常的dsRNA被Dicer酶(RNaseIII家族中成员，负责识别并切割dsRNA)特异性识别并切割成长为21-23nt的短双链RNA，称为小干扰RNA(siRNA)；siRNA与细胞内的核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)，作用是对靶mRNA进行识别和切割。RISC的解旋酶将其中的siRNA变成单链，成为有活性的RISC，RISC与靶mRNA互补结合，利用自身核酸内切酶活性将mRNA切断降解。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，RISC中的siRNA与靶mRNA结合时还可以作为引物，在RNA聚合酶(RdRp)的作用下，合成更多新的dsRNA。RNAi的核心途径可以简单概括为起始、效应、放大三个阶段。

除了siRNA，微小RNA(miRNA)也是基因表达的转录

后调控因子。miRNA是生物体中普遍存在的内源性的具有发夹结构的单链转录产物，它通过RNAi机制发挥生物学作用，靶向抑制mRNA翻译[1]，从而参与真核生物的几乎所有基因的表达调控。一些研究表明，外源导入的siRNA能使体内和体外细胞的RNAi途径饱和，导致参与竞争的siRNAs的效果下降，而增加他们的靶基因的表达水平。而siRNAs使RNAi途径饱和的同时，也能导致内源性miRNA的功能失调[2，3]。即，外源引入的siRNA与内源性miRNA这两种小RNAs都与RNAi途径相关。

2 RNAi的动力学及建模

起始阶段，dsRNA被dicer酶剪切成siRNA。有实验[4-6]表明dsRNA的初始剂量越大产生的沉默效应越显著。也就是说，RNAi反应程度是受dsRNA初始剂量大小的影响。2005年，Groenenboom MA等人[7]对核心途径建立了三个扩展模型对RNAi的剂量依赖性做出了系统生物学阐述。其中“RNase模型”说明了特异性核糖核酸酶(RNase)降解siRNA涉及的饱和动力学，即剂量依赖是由于siRNA降解酶的饱和引起。通过模型证实了每个mRNA产生的dsRNA数是确定阈值的主要因素，即每个mRNA产生的dsRNA越多，触发基因沉默的阈值越低。同理，增加RdRp合成dsRNA的速率也可以使相关模型的阈值降低。另外一些研究也表明了阈值的存在：Lipardi等人[8]发现在果蝇胚胎提取的dsRNA剂量低于阈值浓度不能诱发RNAi，而十倍剂量时便能够触发RNAi；Li等人[9]的结果也说明了在斑马鱼胚胎，小剂量的dsRNA只引起部分表型的改变，而高剂量的dsRNA引起超过50%部分表型和35%全部表型的改变。部分表型的效果可以表明胚胎体内只有短暂的反应，而高剂量的dsRNA触发全部表型改变能够表明有持续的反应。因此，RNAi的启动依赖于dsRNA的初始剂量。另外，目前发现影响RNAi速率的生物成分还有Dicer酶[10，11]和Exportin-5[12]、dCRIF[13]等。

效应阶段，siRNA参与形成RISC，RISC与靶mRNA结合并将靶mRNA降解。在转染实验中观察到同时引入2个或更多人工siRNAs会使其中某种siRNA基因沉默活性减低[1,14-17]。因此RISC形成过程中小RNAs间的竞争是RNAi的重要限速因素。Loinger A等[18]提出了一个基于速率方程的精细模型，揭示了由于各种不同小RNAs之间的竞争引起的基因表达的整体变化。现已发现这主要是由于miRNA与外源性siRNA竞争Argonaute蛋白(Ago蛋白)引起，Ago蛋白是形成RISC的核心组件[19]，siRNA需装载在Ago蛋白上才能引起基因沉默效应[20]。有研究发现真核生物细胞仅供应有限的几种类型的Ago蛋白，比如人体细胞提供4种类型的Ago蛋白[11]，限制siRNA/miRNA参与组装RISC的能力[16-17,21-24]。越来越多的证据表明，RISC的催化成分与Ago蛋白的相互作用，是RNAi途径的关键限速步骤。Khan等[3]也应用系统生物学方法对小RNAs转染实验的数据进行统计分析，并通过构建线性消退模型，证实了细胞内RNAi的过程具有饱和效应，RNAi的沉默速率与这种饱和效应密切相关。

放大阶段，以siRNA为引物、mRNA为模板在RdRp的作用下，合成更多的dsRNA。2003年，Bergstrom CT等人[25]提出了关于RNAi的单向放大模型，从RdRp的分子生物学角度说明在RdRp聚合作用下产生的dsRNAs与启动沉默过程的dsRNAs不同。发生这种不同的原因是RNA聚合作用具有从5'到3'端的单向性，即合成dsRNA时，RdRp仅在引物片段的3'端方向操作，向引物片段上游延伸，上游的siRNAs在每一轮放大都增加，在连续一轮轮的放大之后，上游的siRNAs的不断增多，而siRNA的分子数越来越小，直到siRNA分子数小至siRNA上游不能准备进一步的聚合，沉默反应最终消失。这一单向放大模型说明了沉默效应不能永久持续，单向放大确保沉默反应将仅在持续输入dsRNA的情况下持续下去，即RNAi效应的持续需要dsRNA的浓度维持在某个特定范围。而由于哺乳动物体内缺乏RdRp，他们只能被dsRNA诱导短暂的沉默[26]，而缺乏了放大阶段，因此维持沉默效应只有通过不断输入dsRNA来完成。2006年，Derek W.Bartlett和Mark E.Davis[27]对哺乳动物体内RNAi动力学的研究是实用且具有代表性的。他们研究RNAi从siRNA递送到细胞内起效的过程，研究主要对比了哺乳动物体内快速分裂细胞、慢分裂细胞与不分裂细胞中RNAi的效应程度和持续时间的影响因素，发现siRNA数量对基因沉默的作用大小有重大的影响，而对总持续时间影响较小；细胞倍增引起的稀释效应造成分裂细胞的基因沉默持续时间缩短；不分裂细胞基因沉默的持续时间不受细胞分裂稀释作用的控制，而是受来自细胞内siRNA内在的稳定的影响。这些结论在我们研究基因功能与基因治疗中，能帮助我们分析和制定产生效应的siRNA阈值、效应持续时间、影响因素及变化特点等。

3 展望

综上，尽管目前RNAi技术用于抑制基因的表达已相当成熟，但RNAi在用于基因治疗上仍面临很大的挑战，不仅包括siRNA递呈的载体和方式，更重要的内容是如何根据基因沉默的阈值、细胞增长率、siRNA稳定性等参数来指定给药方案。尽管RNAi的系统生物学研究使我们对RNAi的机制有了更深的理解，但现阶段我们还缺少大量的实验来验证我们设计的每一个模型是否真实有效，另外，已有模型尚不能模拟RNAi的全过程。随着人们不断的探索创新与完善，相信将来RNAi技术不仅在科研上而且在临床上也能得到广泛应用。

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吉林省自然科学基金项目(201215069)

1007-4287(2016)10-1783-03

2016-05-10)

*通讯作者