宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性

管　峰，高　威，陈吉刚，毛芝娟，杨季芳*

(1. 浙江万里学院 生物与环境学院 浙江 宁波 315100；2. 宁波市微生物与环境工程重点实验室 浙江 宁波 315100)



宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性

管峰1,2，高威1，陈吉刚1,2，毛芝娟1,2，杨季芳*1,2

(1. 浙江万里学院 生物与环境学院 浙江 宁波 315100；2. 宁波市微生物与环境工程重点实验室 浙江 宁波 315100)

摘要:本文调查分析了宁波-舟山港口航道副溶血弧菌 Vibrio parahemolyticus、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila的毒力特征和耐药性特点。用PCR方法检测分离菌株的毒力基因分布模式发现，副溶血弧菌毒力基因型以gyrB+，toxR+，tlh+和tdh+为代表，溶藻弧菌毒力基因型以aspA+，tlh+，collagenase+和toxS+为代表，嗜水气单胞菌毒力基因型以aerA+，alt+，aha1+和hlyA+为代表；副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌代表菌株相应基因的检出率分别为57.1%、40.0%和50.0%。用24种常见抗生素对3种细菌的分离代表菌株进行药敏调查，耐药率分别为4.17%、8.33%和29.17%。实验结果表明宁波-舟山港口航道3种致病性细菌具备较丰富的毒力基因种类和耐药性，需要有针对性地制定预防措施。此外，鉴于毒力基因型与致病性之间的相关性，毒力基因可作为标记基因，用于致病性细菌的检测。

关键词:港口航道；致病菌；毒力基因；耐药性

0引言

弧菌属Vibrio和气单胞菌属Aeromonas细菌均属于革兰氏阴性菌，广泛分布于海水中，尤其是近岸海域。这些细菌主要的感染对象有虾、鱼和贝等，不仅是海洋动物的主要致病菌，而且被认为是沿海地区细菌性食物中毒的重要病原菌。由于这类细菌在沿海生态危害以及食源中毒方面的问题日显突出，加深对于它们的认识，对水产动物细菌性疾病的防治，人类细菌性食物中毒的诊断、治疗以及微生态制剂研发等具有重要意义。

宁波-舟山港是世界上最大货物吞吐港口之一，在我国国民经济建设、物种多样性保育和海岸带开发等方面具有举足轻重的作用。受人类活动以及洋流影响，该海域海洋微生物种类多，活性高，同时受偏高水温、多样渔业资源和频繁气候变化等影响，宁波-舟山港细菌数量和差异巨大。因此，研究宁波-舟山港口航道致病性细菌的毒力基因分布情况及耐药规律，对深入探讨致病菌的防控具有重要意义。

在国外，关于海洋细菌学的研究较早就已经开展[1-6]，我国微生物研究者对沿海港口航道海水细菌致病性的研究也有相关报道[7-16]。而对于宁波-舟山港口航道副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌毒力基因型与药物敏感性的研究工作此前鲜见报道。这3种细菌是我国沿海常见的人-畜-鱼共患病原菌，可引起鱼类出血性败血症、肠炎等，也会导致人急性疾病，但病原菌的流行规律及毒力特征至今仍不明确。本研究通过毒力基因和耐药性检测，分析了宁波-舟山港口3种致病菌的毒力特性和耐药特征，以期为海洋细菌致病机理和耐药性研究提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1采样区信息

设置镇海码头、横山码头、白峰码头、沈家门码头和朱家尖大桥等5个样品采集点。按春(4月)、夏(7月)、秋(10月)和冬(1月)四季采集海水表层下30 ~50 cm处水样。每处采集500 mL水样，采样过程均按照无菌要求，样品4 ℃保存，由灭菌管保存并带回实验室，于16 h内处理完毕。采集点信息见表1。

1.1.2主要试剂

所有培养基、生化鉴定试剂均购自青岛海博生物公司；2×Taq MasterMix(含染料)购自北京康为世纪生物公司；pMD18-T载体和DL 2000 marker购自Takara公司；药敏纸片购自英国Oxoid公司；无菌脱纤维绵羊全血(瓶装)购自杭州新锐生物工程有限公司。

1.1.3标准菌株

标准菌株副溶血弧菌ATCC 17802、溶藻弧菌ATCC 17749和嗜水气单胞菌ATCC 7966等由宁波市微生物与环境工程重点实验室保存。

表1　采样点位置

1.2方法

1.2.1菌株分离

样品25 mL无菌接种225 mL碱性蛋白胨水28 ℃增菌培养6~8 h。取培养物接种TCBS琼脂，置28 ℃培养18~24 h。从被检材料分离目标菌株，纯培养后-70 ℃保存备用。

1.2.2常规生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]和《伯杰氏细菌学鉴定手册》[18]方法，以标准菌株作为参照对分离菌株进行生理生化特征测定。

1.2.316S rDNA分子鉴定

将新鲜培养的菌液煮沸后离心取上清液作为基因组模板。用16S rDNA通用引物27 F和1492 R扩增细菌基因组，将PCR产物连接到pMD18-T载体上进行克隆测序。用Clustal X2软件进行序列比对，再用Mega 6.0软件构建N-J系统发育树，并进行1 000次Bootstraps重复检验。

1.2.4毒力基因检测

将毒力基因引物扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段回收纯化，T载体连接克隆转化，鉴定无误送上海生工测序。

1.2.5耐药性检测

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的执行标准，耐药性检测采用Kirby-Bauer 纸片琼脂扩散法，选择24 种常用的抗生素进行实验。以标准菌株作为质控菌株。结果判定按NCCL 2003 版执行，耐药性分为3个层次：敏感(S)、中度敏感(I)和耐受(R)。

1.2.6溶血性实验

将无菌的10%脱纤维绵羊全血平板或者哥伦比亚血平板(自制)复温至25 ℃后，挑取分离菌株划线接种于绵羊全血平板或者哥伦比亚血平板上，28 ℃培养，24~48 h后观察溶血现象。若菌落周围出现溶血环，表明该细菌具溶血能力，是潜在的病原菌；溶血环越大，其致病力也可能越强。若菌落周围未出现溶血环，表明该细菌无溶血能力。

2结果与分析

2.1菌株鉴定结果

本研究分离出致病性副溶血弧菌7株，致病性溶藻弧菌3株，致病性嗜水气单胞菌4株，实验室分别编号为VP(1~7)、VA(1~3)和AH(1~4)。由表2可见VP(3、5、7)、VA(1、2、3)和AH-1分别是副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌中溶血性能最强的菌株，选择VP-3(VP LWW01109)、VA-1(VA LWW01106)和AH-1(AH LWW17749)作为后续实验菌株。由表3可见实验菌株生理生化结果与陆源同种细菌结果基本一致[17-18]。

表2　3种细菌分离菌株的溶血特征

注：+++++：溶血能力最强；++++：溶血能力较强；+++：溶血能力中等；++：溶血能力较弱；+：溶血能力弱；-：无溶血能力。

表3　代表菌株的生理生化特性

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性

2.2序列分析

图1　代表菌株16S rDNA基因核苷酸序列的系统进化树分析Fig.1　Phylogenetic trees of 16S rDNA ofrepresentative strains

分离菌株经16S rDNA扩增产物纯化，克隆并测定序列。细菌16S rDNA基因1 466个核苷酸序列比对表明，菌株VP LWW01109与副溶血弧菌核苷酸序列相似性超过98%，菌株VA LWW01106与溶藻弧菌核苷酸序列相似性最高，菌株AH LWW17749与嗜水气单胞菌核苷酸序列相似性最为接近(图1)。序列分析结合生理生化特性结果表明，菌株VP LWW01109为副溶血弧菌，菌株VA LWW01106为溶藻弧菌，菌株AH LWW17749为嗜水气单胞菌。

2.3毒力基因分布模式

分离菌株基因组DNA经PCR扩增后，毒力基因扩增片段与预期片段大小一致。将扩增产物克隆测序，经Blast序列比对，扩增片段均为目的基因。

对所有分离株细菌毒力基因进行检测发现，每株细菌的毒力基因型都不相同，副溶血弧菌均能检出gyrB+和tlh+，最复杂的毒力基因型是gyrB+、tlh+、toxR+和tdh+；每株溶藻弧菌只含有1~2种毒力基因；每株嗜水气单胞菌含有1~4种毒力基因不等，最复杂的是aerA+、hlyA+、aha1+和alt+，多样性较为丰富。代表菌株的毒力基因种类及检出率如表4所示。

2.4耐药性特征

对具有强溶血能力的VP LWW01109、VA LWW01106和AH LWW17749进行抗生素耐药性检测，耐药性特征见表5。为便于统计，耐药性处于中度敏感(I)并入耐药(R)分析代表菌株对抗生素的耐受性，计算耐药性时仅统计耐药(R)的数量。结果表明具有强溶血能力的细菌普遍存在耐药性。VP LWW01109对氨基糖苷类、大环内脂类、多肽类、部分β-内酰胺类、利福霉素类和香豆素类抗生素具有耐受性，耐药率为4.17%。VA LWW01106对氨基糖苷类、多肽类、大部分β-内酰胺类、香豆素类抗生素以及克拉霉素、克林霉素和磷霉素等有一定耐受性，耐药率为8.33%。AH LWW17749对大环内脂类、四环素类、多肽类、部分β-内酰胺类、利福霉素类和香豆素类抗生素等有耐受性，耐药率为29.17%。

表4　代表菌株的毒力基因种类

表5　代表菌株对24种抗生素的耐药性特征

注：R表示耐受，I表示中度敏感，S表示敏感

3讨论

在我国大榭港[9]、秦皇岛港[12, 14]、烟台港[13]和盐田港[15]等地分别发现致病性弧菌(如副溶血弧菌、创伤弧菌)、致病性单胞菌(如嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌)和致病性肠杆菌(如大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌)等。本研究中分离的副溶血弧菌和溶藻弧菌是宁波-舟山港口航道的优势弧菌种(数据另文发表)，这与我国沿海五省——山东、上海、浙江、广东和海南发现的致病性弧菌构成以溶藻弧菌和副溶血弧菌占多数[19]基本相符。盐田港海水优势弧菌种为溶藻弧菌(39.13%)和创伤弧菌(17.39%)[15]，珠海港海区多达10种弧菌为主要分离菌[8]，与宁波-舟山港区检出情况略有不同，表明不同的海域优势菌种也存在区域性差异。盐田港压舱水优势弧菌种为溶藻弧菌(34.69%)和副溶血性弧菌(28.57%)[15]；珠海港压舱水中致病性弧菌比海水中种类更多、污染更为严重[8]；山东日照港、烟台港和青岛港压舱水中气单胞菌和溶藻弧菌有较高检出率，而副溶血弧菌检出率较低[13, 16]，说明港区中致病菌种类和数量很可能受压舱水排放影响，可通过病原菌溯源追查两者之间的联系。

我国沿海细菌耐药性的研究较少，而宁波-舟山港口航道细菌的耐药性更缺乏研究。弧菌属和气单胞菌属细菌分布于海洋，耐药属性普遍存在，尤其沿海生活、医用废水将大量抗生素带入海中更是激发细菌耐药性的产生。本研究显示在宁波-舟山港口航道具备强致病性的细菌也具有广谱的耐药性。ROQUE et al[20]的研究发现副溶血弧菌对氨苄西林耐药率超过65%。胡珑玉 等[21]发现溶藻弧菌具有严重的多种耐药性，对四环素和青霉素类抗生素耐药率超过90%。本研究发现，分离菌株对红霉素、青霉素等具有较强耐受性，说明分离海水受到临床抗生素以及水产抗生素的污染，并使细菌产生耐药性。例如新霉素、克拉霉素、万古霉素等一般仅用于临床治疗，而卡那霉素和新生霉素可用于水产养殖疾病预防。本研究发现嗜水气单胞菌分离株对新生霉素和四环素具有耐药性，这与新生霉素和四环素作为预防性抗生素添加剂在饲料中投放入海水，导致海洋细菌对它们产生普遍抗药性有关，特别是弧菌属和气单胞菌属[22]。KABIR et al[23]研究表明霍乱弧菌对β-内酰胺类抗生素可形成具有抗性的L型形态，在一定程度上解释了未接触过抗生素的弧菌属细菌对氨苄青霉素具有耐药性的原因。喹诺酮类抗生素在水产养殖中使用较为广泛，已被证明具有高效治疗效果，其耐药性发生的频率也较低，并且针对弧菌属具有杀菌活性[24]，这也与本研究结果一致。值得注意的是，3株代表细菌都发现具备中等以上耐受万古霉素的能力，而这种抗生素通常被认为与其他抗生素无交叉耐药性，并且较难形成耐药菌株，通常用于耐药致病菌的治疗。这可能与宁波-舟山沿海养殖防治弧菌病或者气单胞菌引发的综合征有关，建议交叉使用环丙沙星等既廉价又高效的抗生素，可减少海洋细菌耐药性的产生。

虽然普遍认为致病菌的检出与疾病发生之间并没有必然的联系，暴发细菌性疾病需要致病菌在一定的环境中达到最低致病量以上，但是致病菌的检出提示了感染风险和危害，因此不宜在宁波-舟山港口航道附近进行海产养殖，以防人-鱼虾贝的食源性细菌传播。根据实地调查，由于可利用的海岸带有限，客运码头1 km外存在围网养殖和鱼排养殖现象，危害性风险较大，一方面养殖海洋生物会增加带菌风险，另一方面养殖废水中超标的有机物也会造成水体的富营养化，进一步刺激细菌的增生。而且人类的医疗、工农业生产以及饲用抗生素引起水体中的病原菌耐药性的问题也亟需关注，由此需要更多监测近海微生物致病基因和耐药性的变化，发展新型控制病原菌技术以及制剂，保证生产、生活安全。

4小结

本研究发现在宁波-舟山港口航道分离获取的副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌菌株的毒力基因分布呈现多样性，代表菌株的毒力基因检出率分别达到57.1%、40.0%和50.0%。3种细菌对常见抗生素耐药谱较广，代表菌株的耐药率分别为4.17%、8.33%和29.17%。耐受的药物主要分布于常用的氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素。另外，3种细菌的代表菌株都对万古霉素产生或强或弱的耐药性，说明港口航道中致病菌危害较大，需要加强对此海域细菌的监管。

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three pathogenic bacteria isolated from the channels and

ports in Ningbo and Zhoushan

GUAN Feng1, 2，GAO Wei1，CHEN Ji-gang1, 2，MAO Zhi-juan1, 2，YANG Ji-fang*1, 2

(1.FacultyofBiological&EnvironmentalScience,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China;

2.MunicipalKeyLaboratoryofMicroorganismandEnvironmentalEngineering,Ningbo315100,China)

Abstract:Virulence characteristics and antimicrobial susceptibility of Vibrio parahaemolyticus(VP), Vibrio alginolyticus(VA) and Aeromonas hydrophila(AH) isolated from the channels and ports in Ningbo and Zhoushan were investigated. The distribution patterns of virulent genes in isolated pathogenic bacteria are found that VP is represented by tlh+, toxR+, gyrB+and tdh+; VA is represented by aspA+, tlh+, collagenase+and toxS+; AH is represented by aerA+, alt+, aha1+and hlyA+. The detection rates of relevant genes in representative strains for these three kinds of bacteria are 57.1%, 40.0%, 50.0%. 24 common kinds of drug resistance rates of representative strains are 4.17%, 8.33% and 29.17% respectively. The results show that harmful characteristics of the pathogenic bacteria are found in Ningbo-Zhoushan, and the right defense measures needed to make to prevent them. Moreover, the correlation of virulence genotypes and pathogenicity of the bacteria show that virulent genes can be chosen as gene-markers to detect pathogenic strains of bacteria.

Key words:channels and ports; pathogenic bacteria; virulent gene; antimicrobial susceptibility

通讯作者：*徐善良(1962-)，男，教授，主要从事海水鱼类苗种繁育研究。E-mail:xushanliang@nbu.edu.cn

作者简介:王腾飞(1989-)，男，安徽阜阳市人，主要从事海水鱼类健康养殖研究。E-mail:15267850309@163.com

基金项目:宁波市科技重大专项项目资助(2015C110003)

收稿日期:2015-01-23修回日期:2015-07-30

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.009

中图分类号:Q938.8

文献标识码:A

文章编号:1001-909X(2015)04-0077-06