鲍及牡蛎内脏可溶物培养球等鞭金藻的效果

黄世玉，张丽莉

(1.集美大学 水产学院, 福建 厦门361021；2.农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门361021)



鲍及牡蛎内脏可溶物培养球等鞭金藻的效果

黄世玉1,2，张丽莉1,2

(1.集美大学 水产学院, 福建 厦门361021；2.农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门361021)

摘要:在培养基中添加鲍及牡蛎内脏团可溶物来培养球等鞭金藻Isochrysis galbana，测定了藻细胞密度、藻细胞叶绿素a和类胡萝卜素含量。结果表明，适宜添加量的鲍及牡蛎内脏可溶物对金藻生长具有促进作用，发酵过的内脏团比不发酵的促进效果更好。1∶1 000比例添加的发酵牡蛎内脏可溶物促进金藻生长的效果最好，其次是1∶100比例的发酵鲍鱼内脏可溶物；这2组的藻细胞叶绿素a和类胡萝卜素含量显著低于其它组。按1∶100比例添加的牡蛎内脏可溶物对金藻生长有抑制作用。

关键词:金藻； 生长； 鲍鱼内脏； 牡蛎内脏

0引言

球等鞭金藻Isochrysisgalbana属于金藻门、普林藻纲、等鞭藻目、等鞭藻科。其藻体细胞小，生长繁殖快，富含水产动物生长发育所需的不饱和脂肪酸,由于其细胞壁不含纤维素，易于消化，因此成为水产经济动物苗种生产中重要的饵料藻类。此外，球等鞭金藻总油脂含量高，富含多糖、类胡萝卜素、抗氧化剂等生物活性物质,在生物能源和医疗保健方面具有较高的利用价值。但球等鞭金藻对营养需求严格，其培养液配方复杂，培养过程中容易被其它微藻和原生动物等污染，较难实现稳定的高密度培养，成为限制球等鞭金藻开发利用的瓶颈[1-2]。

鲍和牡蛎是我国主要的贝类养殖种类。鲍内脏在鲍深加工过程中一般作为下脚料抛弃。牡蛎主要以鲜食为主，食品加工尚处于初级阶段，产品以蚝干、罐头和耗油为主。目前我国对牡蛎的加工和综合利用还不充分。而且由于鲍和牡蛎内脏容易滋生微生物，腐败变质速度快，致使大量贝类内脏被直接抛弃，浪费资源、污染环境。鲍和牡蛎内脏是沿海地区容易获得的材料，本文利用鲍和牡蛎内脏可溶物来培养金藻，探讨其培养效果，该研究不仅为利用鲍和牡蛎内脏提供一个新途径，而且为优化金藻培养条件提供一个新方法。

1材料与方法

1.1藻种及培养条件

球等鞭金藻购自厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室海洋藻类保种中心。培养用海水为砂滤海水，经脱脂棉过滤后，120 ℃ 30 min灭菌处理。藻种接种于500 mL三角烧瓶中于光照培养箱中培养。培养温度为25 ℃，光周期为L∶D=14 h∶10 h,光强4 000 Lx,每天早、中、晚分别摇动1次。每个实验组设置3个平行样，藻种接种密度约100万个/mL。

基础培养液为f/2培养液[3]，根据实验设计相应添加不同比例的鲍或牡蛎内脏可溶物提取液。

1.2鲍和牡蛎内脏可溶物制备

取新鲜的6只鲍内脏团，经65 ℃烘干48 h，用玻璃匀浆器充分碾磨，准确称取2 g，转移至20 mL双蒸水中充分搅拌6 h，以促进可溶物提取。将该悬浊液均分为2份。其中1份离心(2 000 r/min，5 min)后取上清液于-20 ℃保存备用。另1份于室温存放48 h自然发酵后，同样离心后取上清液于-20 ℃保存备用。培养金藻时，按内脏可溶物上清液∶f/2培养液为1∶100、1∶1 000和1∶10 000的体积比添加，并设置1组f/2基础培养液的作为对照组。

牡蛎内脏可溶物的制备及添加同鲍内脏处理过程。

1.3金藻样品收集及指标测定

1.3.1金藻生长测定

每天用血球计数板计数金藻细胞密度，同时按照下列公式计算金藻日生长速率(μn)：

μn=(lnXtn-lnXtn-1)

(1)

式中：Xtn和Xtn-1为第n天和第n-1天的细胞密度，单位：×104/ mL；本实验中n的取值范围为2~7。

1.3.2金藻样品收集

培养至第7天时，将藻液转移至50 mL离心管，3 000 r/min，离心15 min，弃上清液，将藻膏用双蒸水冲洗离心3次，将藻膏定容至2 mL无菌海水中，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.3叶绿素a及类胡萝卜素的测定

取上述藻膏400 μL至5 mL样品管，4 000 r/min，离心10 min。倒去上清液，加4 mL丙酮，避光在4 ℃下萃取24 h后，再4 000 r/min,离心10 min，取上清液分别在特定波长470、662和645 nm读取吸光度值。根据以下公式计算叶绿素a(Chla)和类胡萝卜素(Car)的含量[4]：

Chla=(11.75A662-2.350A645)×V/金藻个数

(2)

Chlb=(18.61A645-3.960A662)×V/金藻个数

(3)

Car=(1 000A470-2.270Chla-81.4Chlb)/

(227×V/金藻个数)

(4)

式中：A为相应波长下的吸光度，V为丙酮提取液体积(4 mL)，金藻个数为400 μL中所有藻细胞数量。公式计算后得到单位为pg/个。

藻细胞密度、日生长率、叶绿素a含量及类胡萝卜素含量用单因素方差分析进行显著性检验，Ducan进行多重比较分析。

2结果

2.1鲍内脏发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响

鲍内脏发酵可溶物对金藻生长的影响如图1所示。方差分析表明不同添加比例可溶物在培养第3天时，1∶100添加组的日生长率最高，为225%，显著高于其它组(p<0.05)；另外，1∶10 000添加组和1∶1 000添加组的日生长率也都显著高于对照组(p<0.05)。

图1　鲍内脏发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响Fig.1　The effect of solvend from fermented abalone visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

在培养至第5天时，1∶100添加组的藻细胞密度最高达到810万个/mL，显著高于其它组(p<0.05)；对照组的藻细胞密度最低，为215万个/mL，显著低于其它组(p<0.05)。培养至第6天时，1∶100添加组的藻细胞密度继续增加至最高点，为992万个/mL，显著高于其它3组(p<0.05)，而其它3组之间没有显著性差异。培养至第7天时，1∶100添加组的藻细胞密度开始下降，但是仍高于其它3组;对照组的藻细胞密度增加迅速，仅次于1∶100添加组，显著高于其它2个添加组(p<0.05)。

2.2鲍内脏未发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响

鲍内脏未发酵可溶物对金藻生长的影响如图2所示。除第1天外，金藻日生长率都存在显著性差异(p<0.05)。对照组的日生长率波动非常大，第2天时为164%，但第3天到第5天都是负增长。未发酵可溶物添加组在培养至第4天时，日生长率约为100%。其中1∶100添加组在第5天时，日生长率还是维持在较高的水平。而对照组在第6天和第7天时，日生长率才开始恢复，超过了添加组(p<0.05)。

图2　鲍内脏未发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响Fig.2　The effect of solvend from unfermented abalone visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

培养至第4天时，添加组的藻细胞密度显著高于对照组(p<0.05)。第5天时，1∶100添加组的藻细胞密度为873万个/mL，达到最高点，显著高于其它3组(p<0.05)。

2.3牡蛎内脏发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响

牡蛎内脏发酵可溶物对金藻生长的影响如图3所示。在第2天到第5天中，1∶1 000添加组的藻细胞在各组中一直保持最高的日生长率。其中在第2天和第5天显著性高于其它3组(p<0.05)。1∶100添加组的日生长率一直维持在比较低的水平；从第3天到第7天中，只有第6天的日生长率是正增长，其它均为负增长。1∶10 000添加组的日生长率几乎与对照组相同。

图3　牡蛎内脏发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响Fig.3　The effect of solvend from fermented oyster visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

在培养到第5天时，1∶1 000添加组的藻细胞密度最高，为1 300万个/mL，是试验过程中获得的最高值。不仅显著性高于其它牡蛎内脏发酵可溶物添加组，也显著性高于所有其它试验组(p<0.05)。

2.4牡蛎内脏未发酵物不同添加比例对金藻生长的影响

牡蛎内脏未发酵可溶物对金藻生长的影响如图4所示。金藻的日生长率在第2天存在显著性差异，1∶1 000添加组显著性高于其它3组(p<0.05)。但是对照组也显著性高于其它2个添加组。第4天和第5天时，1∶1 000添加组维持了较高的日生长率。第6天时，对照组的日生长率显著性高于其它3个添加组。

1∶1 000添加组的藻细胞密度在第6天达到最高点。并且在第4天到第7天中，一直是各组中藻细胞密度最高的。但在第7天时，与1∶10 000添加组和对照组没有显著性差异(p>0.05)。

图4　牡蛎内脏未发酵可溶物不同添加比例对金藻生长的影响Fig.4　The effect of solvend from unfermented oyster visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

2.5添加内脏可溶物对金藻叶绿素a含量的影响

培养至第7天后，离心收集各组金藻，测定叶绿素a的含量，结果如图5所示。鲍和牡蛎内脏可溶物不管是否经过发酵都对培养金藻的叶绿素a含量有显著性影响(p<0.05)。在鲍内脏发酵可溶物和未发酵可溶物处理中，1∶100添加组叶绿素a含量最少，显著低于其它3组(p<0.05)。而1∶1 000添加组叶绿素a含量最高，高于其它3组(p<0.05)。牡蛎内脏发酵可溶物和未发酵可溶物处理中，1∶100添加组的叶绿素a含量显著高于其它3组，而另外3组叶绿素a的含量没有显著性差异。

图5　鲍和牡蛎内脏可溶物对金藻叶绿素a含量的影响Fig.5　The effect of solvend from abalone or oyster visceral mass on the chlorophyll a contents of I. galbana

2.6添加内脏可溶物对金藻类胡萝卜素含量的影响

各实验组收集的金藻中类胡萝卜素含量如图6所示。鲍内脏发酵和未发酵可溶物两种处理中，都是1∶100添加组的类胡萝卜素含量最低，显著低于其它3组(p<0.05)，但是其它3组之间没有显著性差异(p>0.05)。牡蛎内脏发酵可溶物和未发酵可溶物两种处理中，1∶100添加组的类胡萝卜素含量最高，显著高于其它3组(p<0.05)。

图6　鲍和牡蛎内脏可溶物对金藻类胡萝卜素含量的影响Fig.6　The effect of solvend from abalone or oyster visceral mass on the carotenoid contents of I. galbana

3讨论

微藻的大规模高效培养是微藻利用的基础和关键技术之一[5]。作为重要水产饵料和富含生物活性物质的球等鞭金藻，其大规模高效培养一直受到科技工作人员的高度重视[5]。而培养基营养成分是影响金藻生物量最重要的因素。目前对球等鞭金藻营养成分的需求主要集中在氮源、磷源、碳源、铁源和硅源等无机营养盐的研究[2,5-8]。但是对于有机物对球等鞭金藻生长影响的研究相对较少。一般认为异养培养会抑制球等鞭金藻的生长[9-10]，相对于其它常用饵料微藻，球等鞭金藻对培养基营养要求更苛刻[7]。快速方便的高密度培养球等鞭金藻一直是水产科技人员需要解决的问题。

在起始密度约100万个/mL的情况下，采用无机营养盐培养球等鞭金藻在第7天以后，可以获得300~500 万个/mL 的生物量[6,8,10-11]。本文采用适当配比的鲍或牡蛎内脏可溶物培养到第5天时就能够达到600万个/mL以上的生物量，远远高于对照组。这表明添加鲍或牡蛎内脏可溶物能够获得较高密度的球等鞭金藻。

添加鲍或牡蛎内脏可溶物后，球等鞭金藻一般在第2天就能获得较大的日增长率。这尚处于培养的起始阶段，球等鞭金藻所需的营养物质供应充足，不存在短缺的问题。因此，内脏可溶物中含有促进球等鞭金藻生长的物质，能够使球等鞭金藻高于正常的速率生长。值得注意的是，添加发酵过的内脏可溶物相对于添加未发酵的内脏可溶物，能够获得更多的生物量。这表明对金藻生长的促进作用是经过微生物分解的物质，或者是微生物的代谢产物。赵培 等[12]发现赤霉素可以影响球等鞭金藻的细胞形态，使之长时间保持在指数增长期。经发酵后的鲍和牡蛎内脏可溶物中的某些物质可能发挥了类似植物激素的作用，全方位提高了藻细胞光合作用的强度和合成物质的能力，并且促进了藻细胞的分裂增殖。

微藻快速生长的生理基础是其藻细胞具有较高的活性，能够保持快速的分裂增殖。微藻在指数增长期光合色素的含量要远远低于平台期[13]。在营养限制的条件下光合色素会降低,同时生物量也会显著降低[14]。脂肪酸等营养物质的积累一般与生长负相关[8]。而本试验的结果表明，1∶1 000比例添加的发酵牡蛎内脏可溶物等高生物量组别的叶绿素a含量要低于其它组别。本试验中藻细胞不可能受到营养限制，因此高生物量组的光合色素应当能够满足藻细胞的正常需要。其叶绿素a含量较低表明其藻细胞将主要物质和能量主要用来合成细胞必需组成成分，进行细胞分裂增殖，而不是进行某种营养物质的积累。在光合色素能够满足基本需求的情况下，没有必要进行大量的色素积累。

已有报道多采用葡萄糖、甘油、乙酸盐等单一碳源对球等鞭金藻进行异养培养，但效果较差[10]，尚未有利用多肽、氨基酸等物质异养培养球等鞭金藻的报道。在添加甘油作为碳源进行兼养培养时，能有效提高球等鞭金藻生物量[10,15]。这表明球等鞭金藻具有直接利用外界有机物质的能力，但是对有机物的种类有选择。贝类内脏含有丰富的多肽和氨基酸[16-17],添加内脏可溶物能够比较全面地补充球等鞭金藻各种的营养需要，因此能够获得较高的生物量。

牡蛎内脏含有丰富的Na、Cu、Zn、Fe、Sr、Mn和Ca[16]，鲍内脏含有Ca、Mg和K[17]等矿物质，而适宜浓度的 Cu、Zn、Mu、Co和Mn对金藻生长有很好的促进作用[18]，因而发酵牡蛎内脏对金藻生长的影响优于发酵鲍内脏。但是过高浓度的Cu和Zn含量对金藻生长有毒害作用[18]，会抑制金藻的生长。这可能是牡蛎内脏可溶物1∶100添加组球等鞭金藻生长受抑制的原因。

4小结

本文采用鲍及牡蛎内脏可溶物进行球等鞭金藻的培养，1∶1 000添加组的发酵牡蛎内脏可溶物和1∶100添加组的发酵鲍鱼内脏可溶物能够显著提高金藻的生长速度，在培养至第5天藻细胞密度可超过800万个/mL。内脏可溶物中可能存在促进微藻分裂生长的物质，并且能够全面满足金藻的营养需求，因此能够实现金藻的快速高密度培养。

参考文献(References)：

[1] ZHOU Wen-jun, ZHENG Li, ZHENG Ming-gang, et al. Axenation of marine microalgae and effects of axenic cultivation on growth characteristics and biochemical compositions of marine microalgae[J]. Acta Oceanologica Sinica,2013,34(6):177-186.

周文俊,郑立,郑明刚,等.海洋微藻的无菌化处理及对其生长特性和生化组成的影响[J].海洋学报,2013,34(6):177-186.

[2] JIANG Yong-he, LIU Bo, WANG Chen-liang, et al. Effect of nitrogen content on growth and biochemical composition ofIsochrysisgalbana[J]. Journal of Anhui Agriculture Science ,2013，41(22):9 183-9 185.

姜永和, 刘博, 王陈良,等. 氮含量对等鞭金藻生长及生化组分的影响[J]. 安徽农业科学,2013,41(22):9 183-9 185.

[3] GUILLARD R R L, RYTHER J H. Studies of marine planktonic diatoms. I.CyclotellananaHustedt andDetonulaconfervaceaCleve [J]. Canadian Journal of Microbiology,1962,8(8):229-239.

[4] WANG Wen-jie, HE Hai-sheng ,GUAN Yu, et al. Methodological comparison of chlorophyll and carotenoids contents of plant species measured by DMSO and Acetone-extraction Methods[J].Bulletin of Botanical Research,2009,29(2):224-229.

王文杰,贺海升,关宇,等.丙酮和二甲基亚砜法测定植物叶绿素和类胡萝卜素的方法学比较[J].植物研究,2009,29(2):224-229.

[5] ZHU Jun-ying, RONG Jun-feng, ZONG Bao-ning. Factors in mass cultivation of microalgae for biodiesel[J]. Chinese Journal of Catalysis,2013,34(1):80-100.

[7] WU Dian-yun, ZOU Ning, CHANG Lin, et al. The culture research and application prospects ofIsochrysisgalbanaParke [J]. Science & Technology Information,2010(33):28-29.

吴电云,邹宁,常林,等.球等鞭金藻的培养研究进展及应用前景[J].科技信息,2010(33):28-29.

[8] JIANG Bing-fei, SUN Ying-ying, WANG Chang-hai. Effects of different nitrogen and phosphorus concentration on the growth and fatty acid composition ofIsochrysisgalbana[J]. Marine Science Bulletin,2007,26( 5):56-61.

蒋冰飞,孙颖颖,王长海.营养盐对球等鞭金藻生长和脂肪酸含量及组分的影响[J].海洋通报,2007,26(5):56-61.

[9] VAZHAPPILLY R, CHEN Feng. Eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid production potential of microalgae and their heterotrophic growth [J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,1998,75(3):393-397.

[10] ALKHAMIS Y, QIN J G. Cultivation ofIsochrysisgalbanain phototrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions[J]. Biomed Research International,2013,2013(10):doi:10.1155/2013/983465.

[11] ROOPNARAIN A, GRAY V M, SYM S. Influence of nitrogen stress onIsochrysisgalbanastrain U4, a candidate for biodiesel production[J]. Phycological Research,2014,62(4):237-249.

[12] ZHAO Pei, WANG Xue-qing, WEI Dan, et al. Effects of gibberellins on biomass,cell morphology and population activity with different growth stages ofIsochrysisgalbana3011[J]. Journal of Environment and Health,2011,28(5):383-386.

赵培,王雪青,魏丹,等.赤霉素对球等鞭金藻3011生物量、细胞形态与不同生长时期群体细胞活性的影响[J].环境与健康杂志,2011,28(5):383-386.

[13] SIGAUD-KUTNER T C S, PINTO E, OKAMOTO O K, et al. Changes in superoxide dismutase activity and photosynthetic pigment content during growth of marine phytoplankters in batch-cultures[J]. Physiologia Plantarum,2002,114(4):566-571.

[14] ROOPNARAIN A, GRAY V M, SYM D. Phosphorus limitation and starvation effects on cell growth and lipid accumulation inisochrysisgalbanaU4 for biodiesel production[J]. Bioresource Technology,2014,156(2):408-411.

[15] WOOD B J B, GRIMSON P H K, GEMAN J B, et al. Photoheterotrophy in the production of phytoplankton organisms [J]. Journal of Biotechnology,1999,70(1-3):175-183.

[16] ZHANG Cong, LIU Cheng-hui, MA Kun, et al. Analysis of trace elements in Dalian Bay oysters [J]. Food Research and Development,2009,30(7)：130-133.

张聪，刘程惠，马坤,等.大连湾牡蛎中微量元素的分析[J].食品研究与开发，2009,30(7)：130-133.

[17] LIU Dan. Process of a fish sauce made from the abalone viscera with low salt concentration by fermentation traditional[D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University,2012.

刘丹.传统发酵鲍鱼内脏低盐鱼酱油的研究[D].福州：福建农林大学，2012.

[18] ZHAO Liang-xia. The research of biologic characteristic ofDunaliellasalina[D].Hefei: Anhui Agriculture University,2005.

赵良侠.杜氏盐藻生物学特性研究[D].合肥：安徽农业大学，2005.

管峰，高威，陈吉刚，等.宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性[J].海洋学研究,2015,33(4):77-82,doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.009.

GUAN Feng，GAO Wei，CHEN Ji-gang, et al. Virulence characteristics and antimicrobial susceptibility of three pathogenic bacteria isolated from the channels and ports in Ningbo and Zhoushan[J]. Journal of Marine Sciences,2015,33(4):77-82,doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.009.

The effects of solvend from abalone or oyster visceral

mass onIsochrysisgalbanaincubation

HUANG Shi-yu1,2, ZHANG Li-li1,2

(1.CollegeofAuaculture,JimeiUniversity,Xiamen361021,China; 2.KeyLaboratoryof

HealthyMariculturefortheEastChinaSea,MinistryofAgriculture,Xiamen361021,China)

Abstract:The solvend of abalone or oyster visceral mass was added in the culture media of Isochrysis galbana. The algal cell density, chlorophyll a and carotenoid were measured. The results show that the suitable dilution of visceral mass solvend can accelerate the growth of I. galbana. The solvend of fermented visceral mass has better effect on growth of I. galbana than the solvend of unfermented visceral mass. The 1∶1 000 dilution of fermented oyster visceral mass is the best for the growth of I. galbana, while the 1∶100 dilution of fermented abalone visceral mass is next. Contents of chlorophyll a and carotenoid in the two test groups are lower than those of other groups. The 1∶100 dilution of fermented oyster visceral mass can inhibit the growth of I. galbana.

Key words:Isochrysis galbana; growth; abalone visceral mass; oyster visceral mass

通讯作者：*杨季芳(1963—)，男，研究员，主要从事海洋微生物(病毒)生态过程、病原微生物病原病理学研究。E-mail:jfkwlq@163.com

作者简介:管峰(1985—)，男，江苏淮安市人，实验师，主要从事环境病原微生物研究。E-mail:guanfengxy@163.com

基金项目:国家海洋公益性行业科研专项项目资助(201105007-7-Ⅱ)

收稿日期:2015-05-08修回日期:2015-05-28

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.008

中图分类号:Q943.1

文献标识码:A

文章编号:1001-909X(2015)04-0070-07