一株新城疫病毒分离鉴定及分子特性分析

程荣华 呼延含蓉 李蓉 高原 石霖 徐鹏

（1，吉林省畜牧兽医科学研究院 130062；2，吉林省动物疫病预防控制中心 130062；3，辽宁省动物医学研究院 110164；4，锦州医科大学 121001）

一株新城疫病毒分离鉴定及分子特性分析

程荣华1呼延含蓉2李蓉3高原3石霖3徐鹏4*

（1，吉林省畜牧兽医科学研究院 130062；2，吉林省动物疫病预防控制中心 130062；3，辽宁省动物医学研究院 110164；4，锦州医科大学 121001）

新城疫 （Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒 （New castle disease virus，NDV）所引起的禽类一种急性、烈性传染病，其主要侵害鸡和火鸡，发病率和死亡率均非常高，为危害我国养禽业的最严重疾病之一，该病为世界动物卫生组织 （OIE）所规定的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，并为国家中长期动物疫病防治规划 （2012-2020年）所规定的5种优先防治的一类动物疫病之一。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新城疫病毒核酸荧光RT-PCR试剂盒购自于深圳匹基公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂购自大连宝生物公司；Trizol LS和反转录试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 病毒的分离鉴定

对疑似新城疫的脏器样品处理后提取核酸，应用新城疫病毒核酸荧光RT-PCR试剂盒进行新城疫病毒核酸检测。对将核酸检测阳性的样品接种9日龄鸡胚，共接种5个鸡胚，每个接种0.1ml，24～72h后收集尿囊液，按照ND诊断技术国家标准进行HA和HI试验。

1.3 F基因和HN基因的扩增及序列测定

取分离株病毒的尿囊液200μl，按照Invitrogen公司Trizol说明书操作，提取病毒RNA，进行反转录后进行PCR扩增反应，PCR产物送大连宝生物工程公司测序。

1.4 F基因、HN基因系统进化树及同源性分析

从GeneBank下载32株NDV的F基因和19株NDV的HN基因，利用Lasergene7.0软件中的MegAlign将其与该毒株的F基因和HN基因的序列一起进行同源性分析，并绘制基因进化树。

2 结果

2.1 病毒检测及鉴定结果

所接SPF鸡胚在72h内全部死亡，死亡鸡胚全身水肿、充血。收获尿囊液进行HA和HI试验。HA和HI试验结果表明，该毒株的尿囊液可凝集鸡红细胞，HA凝集效价均在26以上，可被ND标准血清所抑制，但不能被禽流感H5、H7、H9亚型的标准血清和EDS-76血清所抑制，新城疫病毒核酸荧光RT-PCR试剂盒进行ND病毒核酸荧光RT-PCR检测均为阳性。将这个毒株命名为CK/JL1/2013，简称为JL1株。

2.2 F基因系统进化树及同源性分析结果

应用Lasergene7.0软件中MegAlign程序中的Clustal W方法进行各序列的同源性比对，并绘制系统进化树；可知，NDV共划分为9个基因型，JL1株归属于基因VII型。

由F基因序列所翻译的氨基酸序列可知，F0蛋白的裂解位点序列为112RRQKRF117，具有强毒株裂解位点特征。JL1株与taiwan95株 （VII型NDV代表毒株）、js02株、La-Sota株和Queensland V4株的F基因的同源性分别为98.3%、98.9%、95.9%和96.6%。

2.3 HN基因系统进化树及序列相似性分析结果

以HN基因ORF序列绘制的进化树显示，JL1株为基因Ⅶ型。同源性分析显示分离株JL1株与Ⅶ型js02株亲缘关系最近，HN基因同源性为99.5%；JL1株与F48E9、Mukteswar、LaSota、Queensland V4间HN基因的核苷酸同源性分别为94.4%、90.6%、89.0%、83.7%。

3 讨论

F蛋白裂解位点是NDV毒力的主要决定因素，但因长期大剂量、高频次的ND疫苗免疫所形成的高免疫压力及RNA病毒自身易变异的特性，NDV在进化过程中容易发生点突变，因此，在NDV的分子流行病学研究中首选对F基因进行分析，同时有大量研究对HN基因进行遗传进化分析。在本研究中，采用HN基因序列进行基因型划分的结果与采用F基因序列进行基因型划分的结果相同，这也与相关研究结果相似。通过裂解位点分析与常用疫苗株LaSota、Queensland V4之间的亲缘关系表明，本次所分离的毒株JL1株属于Ⅶ型，其与目前在养禽业中流行的Ⅶ型ZJ1株的亲缘关系非常近，其与当前所应用的疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。

根据毒力的不同，可将NDV分为3类：强毒株、中强毒株和弱毒株。同时，依据致病性分子基础的F蛋白裂解位点的不同进行分类，中强毒株、强毒株裂解位点氨基酸序列多为112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，弱毒株裂解位点氨基酸序列则多为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117。但目前已经有报道F蛋白的裂解位点处的氨基酸基序可能不一定是NDV毒力的必要因子。本研究对分离到的新城疫毒株的F基因和HN基因进行序列测定与分析，与现行国内外流行毒株的同源性及遗传演化进行了分析，为制定防控新城疫流行的有效对策提供重要的科学依据。

*通讯作者：徐鹏，副教授，研究方向为动物传染病及兽医寄生虫学。