胶原三股螺旋重复蛋白1在HBV肝病中的临床意义研究



胶原三股螺旋重复蛋白1在HBV肝病中的临床意义研究

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高度恶性的肿瘤，全世界每年有25万人死于此病。流行病学资料显示，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是导致HCC形成的最主要因素[1]，但HBV的致癌机制目前还不清楚。胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1, CTHRC1)是2005年发现的一个新基因，参与血管的形成和肿瘤细胞的转移，在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用[2-5]。我们主要探讨了HBV感染对CTHRC1表达的影响，并分析其血清学水平与疾病进程的关系，为揭示HBV的致癌机制和疾病的诊断奠定一定的基础。

材料和方法

一、研究对象

收集临床确诊HBV感染患者369例，其中无症状HBV携带者92例，男52例，女40例，年龄(45±14)岁；慢性乙型肝炎患者106例，男58例，女48例，年龄(47±15)岁；HBV感染致肝纤维化患者94例，男55例，女39例，年龄(51±14)岁； HBV相关HCC患者77例，男48例，女29例，年龄(59±18)岁。所有患者均排除心、脑、肾等重要器官疾病及其他嗜肝病毒的感染。正常对照组为126名无HBV感染的健康人，男69名，女57名，年龄(46±20)岁。

二、材料

人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15由武汉大学典型培养物保藏中心提供；RNA提取试剂TRIzolR购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司；荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物由上海英俊生物技术公司合成；荧光定量PCR 试剂盒购自Roche 公司，CTHRC1抗体及其标准品购自美国Santa Cruz公司。

三、方法

1. 人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15的培养HepG2 和HepG2.2.15细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的1640培养基，在37 ℃恒温箱维持体积分数为5%的CO2的条件下培养。

2. 荧光定量逆转录PCR检测CTHRC1 mRNA采用TRIzolR试剂提取HepG2和HepG2.2.15细胞的总RNA，逆转录出相应的cDNA后采用LightCycler 480 荧光定量PCR 仪进行扩增，按照Roche 荧光定量试剂盒说明进行操作，所有反应均设3个复孔。CTHRC1基因的检测引物为5′-TTCAGTGGCTCACTTCGG-3′(上游引物)和5′-TTCAGGGCTTCCTTGGTC-3′(下游引物)；设β-actin作为内参，引物序列为5′-ATCCACGAAACTACATTCAA-3′(上游引物)和5′-TCTTCATGGTGCTGGGAG-3′(下游引物)。

3. Western blot检测CHTRC1蛋白收集HepG2和HepG2.2.15细胞，加入细胞裂解液，超声破碎后离心取上清蛋白。分别取样本和标准品30 μg加入等体积的上样缓冲液后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，电泳结束后将蛋白转到硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜上，加入抗CHTRC1蛋白抗体，温育洗涤后加入二抗，采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL) 显色系统(君意东方JY-Clear ECL)进行显色。

4. 血清CTHRC1的检测血清CTHRC1检测采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，其水平采用定量方法进行计算。

四、统计学方法

结果

一、HBV上调CTHRC1 mRNA和蛋白的表达

HepG2.2.15和HepG2细胞中CTHRC1 mRNA的相对定量分别为0.583±0.082和0.321±0.058，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。HepG2.2.15细胞CTHRC1蛋白的表达量明显高于HepG2细胞，见图2。

二、HBV患者血清CTHRC1水平

无症状HBV携带者CTHRC1水平为(39.7±10.3)ng/mL，HBV感染相关疾病(慢性乙型肝炎、HBV感染致肝纤维化、HBV相关HCC)患者为(44.8±13.2)ng/mL，正常对照组为(32.6±8.5)ng/mL，三者之间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

三、CTHRC1血清水平与疾病进程的关系

慢性乙型肝炎患者血清CTHRC1水平为(37.5±9. 3)ng/mL，HBV感染致肝纤维化患者为(43.3±14.2)ng/mL，HBV相关HCC患者为(51.2±15.8)ng/mL，三者之间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

注：与HepG2细胞比较，*P<0.05

图1荧光定量PCR检测CTHRC1 mRNA在HepG2.2.15

及HepG2细胞中的表达

图2　Western blot检测CTHRC1 蛋白在HepG2.2.15

注：与无症状HBV携带者比较，*P<0.05

图3正常对照组、无症状HBV携带者及

HBV感染相关疾病患者血清CTHRC1水平的比较

注：与HBV感染致肝纤维化患者比较，*P<0.05

图4慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纤维化患者及

HBV相关HCC患者CTHRC1血清水平比较

讨论

研究表明，全世界累计有3.5亿人感染了慢性乙型肝炎，其中近25%最后发展成为HCC，慢性乙型肝炎患者HCC发病的危险性要比普通人群高出200倍[1]，我国肝癌患者80%以上有HBV感染史。

CTHRC1是近年来发现的一种新型分泌型糖蛋白，含有4个外显子和4个内含子，编码243个氨基酸，相对分子质量为15 000～30 000。研究表明，CTHRC1参与机体骨的生长修复及血管内膜的损伤修复，调节转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)的信号发生[6]。CTHRC1在很多实体肿瘤中异常高表达，如胃肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌和胰腺癌等，并且与肝癌的预后相关[3，7-9]。本研究分别在mRNA水平和蛋白水平探讨了HBV感染对CTHRC1表达的影响。

HepG2.2.15细胞整合了HBV全基因组，是HBV慢性感染重要的细胞模型。本研究检测了HepG2.2.15和HepG2细胞中CTHRC1的表达情况，结果显示HBV能够在HepG2细胞上调CTHRC1 mRNA和蛋白水平表达；无症状HBV携带者血清CTHRC1水平明显高于正常对照组，表明HBV感染能够上调CTHRC1的表达。

HBV感染表现形式多样，包括无症状携带、急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化和肝癌。本研究分析了慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纤维化患者和HBV相关HCC患者的血清CHTRC1水平。结果显示HBV相关HCC患者血清CHTRC1水平最高，其次为HBV感染致肝纤维化患者，慢性乙型肝炎患者最低。由此可见，随着乙型肝炎疾病进程的发展，血清CHTRC1水平不断升高。因此，可以考虑将CHTRC1作为HBV相关疾病诊断的辅助指标之一。

研究表明，CTHRC1能够提高癌细胞的增殖和迁移能力，抑制Ⅰ型胶原的合成，并通过限制胶原基质沉积和促进细胞迁移参与血管的损伤修复和肿瘤的发生、发展过程[5，10]。本研究发现HBV能够在细胞水平上调CTHRC1的表达，并且与疾病进程相关。因此HBV可能通过上调CTHRC1的表达来促进HCC的发生。但HBV调节CHTRC1表达的具体机制尚待进一步探讨。

参考文献

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[3]CHEN YL, WANG TH, HSU HC, et al. Overexpression of CTHRC1 in hepatocellular carcinoma promotes tumor invasion and predicts poor prognosis[J]. PLoS One, 2013, 8(7):e70324.

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[5]PARK EH, KIM S, JO JY, et al. Collagen triple helix repeat containing-1 promotes pancreatic cancer progression by regulating migration and adhesion of tumor cells [J]. Carcinogenesis, 2013, 34(3): 694-702.

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[9]TANG SC, CHEN YC. Novel therapeutic targets for pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(31):10825-10844.

[10]TAMEDA M, SUGIMOTO K, SHIRAKI K, et al. Collagen triple helix repeat containing 1 is overexpressed in hepatocellular carcinoma and promotes cell proliferation and motility[J]. Int J Oncol, 2014 , 45(2):541-548.

(本文编辑：姜敏)

宋惠， 刘兴晖，沈振华，陈庆，徐凤霞，徐莉敏

(上海市浦东新区公利医院检验科，上海200135)

摘要：目的探讨乙型肝炎病毒(HBV) 对胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)表达的影响及其临床意义。方法分别采用实时逆转录聚合酶链反应(PCR)和Western blot 检测人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中CTHRC1 mRNA和蛋白水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 CTHRC1血清学水平，分析非HBV感染的健康人(正常对照组)、无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纤维化患者和HBV相关肝细胞癌(HCC)患者中CTHRC1血清学水平的差异。结果HepG2.2.15细胞中CTHRC1 mRNA的表达水平明显高于HepG2细胞；无症状HBV携带者CTHRC1血清学水平明显高于正常对照组(P < 0.05)；HBV相关HCC患者CTHRC1血清学水平明显高于HBV感染致肝纤维化患者和慢性乙型肝炎患者(P < 0.05)。结论HBV能够上调CTHRC1的表达，其血清学水平与HBV疾病进程相关。

关键词：；胶原三股螺旋重复蛋白1；乙型肝炎病毒；肝纤维化；肝细胞癌

Research on the clinical significance of CTHRC1 for HBVSONGHui，LIUXinghui，SHENZhenhua，CHENQing，XUFengxia，XULimin. (DepartmentofClinicalLaboratory，GongliHospital,Shanghai200135,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of hepatitis B virus(HBV) on the expression of collagen triple helix repeat containing 1(CTHRC1) and its clinical significance. MethodsThe mRNA and protein levels of CTHRC1 in HepG2 and HepG2.2.15 cells were determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (PCR). Serum CTHRC1 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the differences of serum CTHRC1 levels among healthy subjects without HBV infection(control group), asymptomatic HBV carriers, patients with chronic hepatitis B, patients with hepatic fibrosis induced by HBV infection and patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) were analyzed. ResultsThe expression of CTHRC1 mRNA was higher in HepG2.2.15 cells than in HepG2 cells, serum CTHRC1 levels were much higher in asymptomatic HBV carriers than in control group (P < 0.05), and CTHRC1 was detected at higher levels in patients with HBV-related group HCC than in those with hepatic fibrosis induced by HBV infection and chronic hepatitis B (P < 0.05). ConclusionsHBV can upregulate the expression of CTHRC1, which is associated with the progression of HBV infection.

Key words:Collagen triple helix repeat containing 1; Hepatitis B virus； Hepatic fibrosis； Hepatocellular carcinoma

收稿日期：(2015-01-05)

通讯作者：刘兴晖，联系电话：021-58858730。

作者简介：宋惠，女1976年生，学士，主管技师，主要从事细胞病理学工作。

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目(D20122404)；上海市卫生和计划生育委员会科研课题项目(201440459)；浦东新区卫生系统重点学科建设资助项目(PWZx2014-03)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)11-1104-03R446.62

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.011