低氧对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

石雪峰，王立生，格日力



低氧对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

石雪峰，王立生，格日力

作者单位：810001 西宁，青海大学医学院高原医学研究中心（石雪峰、格日力）；100850 北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所（石雪峰、王立生）；810001 西宁，青海省人民医院呼吸科（石雪峰）

近年来，大量研究表明骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）是一群具有多向分化潜能、低免疫原性的多能干细胞，在一定的诱导条件下能最终分化成心肌、骨、软骨、神经等多种组织，易于在体外分离培养，并易于为外源基因转染和表达。这些特性使BMMSCs 成为在细胞治疗、基因治疗中有效发挥疗效的理想工程细胞，展示了其作为一种新的理想干细胞来源在治疗多种缺血缺氧性疾病中的良好应用前景［1-3］。但骨髓中BMMSCs 含量极其稀少，研究显示，BMMSCs 在新生儿骨髓单个核细胞中占 0.01%，随着年龄增大，数量逐渐降低，到 80 岁仅占 0.00005%［4］。而应用于临床治疗的干细胞每次需要 5 千万 ～ 2 亿个，这不可能从一个捐献者体内分离获得［5-7］，而是需要进行体外扩增。但是，BMMSCs 体外增殖亦较慢，因此，如何实现少量取样，批量获取是 BMMSCs满足临床试验研究的当务之急。BMMSCs 的自我更新受多种复杂微环境的调控，如细胞间的接触、各种蛋白及生长因子等，而微环境中的氧张力是调控 BMMSCs 功能的重要因素［8］。早在 1958 年，Cooper 等［9］发现在低氧条件下培养细胞时，细胞的增殖能力增强。骨髓中氧张力仅为 1% ～6%［10-13］，因此，推测低氧可能更适合骨髓间充质干细胞的培养。另外，当缺血性心脏病、缺血性脑病等发生时，局部损伤器官多处于低氧微环境中，局部氧浓度可低于0.2%［14-15］，BMMSCs 移植后疗效的发挥与损伤部位的低氧环境密切相关。因此，开展低氧条件对间充质干细胞生物学特性的研究对于 BMMSCs 的应用具有非常重要的意义。

1　低氧对 BMMSCs 增殖能力的影响

随着干细胞治疗技术的发展，如何提高 BMMSCs 增殖效率成为 BMMSCs 移植治疗的关键。2007 年，Fehrer等［16］研究发现，与常氧培养 BMMSCs 相比，3% 氧浓度培养使 BMMSCs 增殖效率提高约 10 倍。2010年，Dos Santos 等［8］研究发现，在 2% 的低氧条件下培养BMMSCs，其增殖效率明显优于常氧条件，并能很好地维持其免疫原性及分化潜能，研究认为这可能与低氧条件下细胞代谢效率提高有关。Estrada 等［17］同样证明，3% 氧浓度下培养可以明显提高 BMMSCs 增殖效率。研究发现，同等数量的 BMMSCs 在低氧条件下培养到第五代时可获得 1 × 109个细胞，而在常氧条件下培养仅能得到 2 × 107个。总之，低氧可以促进 BMMSCs 的增殖，但是其机制目前尚不明确，可能与 Oct-4 和 Rex-1 表达升高有关［18］，也可能是通过上调 HIF-1α 或 HIF-2α 表达［19］。

2　低氧对 BMMSCs 分化潜能的影响

除了 BMMSCs 的增殖能力，BMMSCs 的分化潜能在干细胞治疗中也有着举足轻重的地位，已有研究发现，1% ～5% 氧张力可以维持 BMMSCs 的多向分化潜能。Raheja等［20］研究发现，21% 的氧张力与 1%、2%、5% 的氧张力相比具有更高的成骨分化潜能，低于 5% 的氧张力可以抑制 BMMSCs 的分化潜能。Holzwarth 等［21］研究发现相对于常氧培养，1% 氧张力可抑制 BMMSCs 的成脂、成骨分化潜能。当氧张力升高到 3% 时，可以恢复其成骨分化潜能。Basciano 等［22］研究发现，相对于常氧培养，5% 氧张力可以促进第二代 BMMSCs 成骨及成脂分化。总之，目前部分研究者认为低氧抑制 BMMSCs 的成骨分化［23-24］，而另有研究者认为低氧可促进 BMMSCs 成骨分化潜能而抑制其成脂分化［25］。因此，目前关于低氧对 BMMSCs 分化潜能的影响颇有争议［26］。

3　低氧对 BMMSCs 迁移能力的影响

可迁移至损伤局部是 BMMSCs 应用于干细胞治疗的另一重要特性。BMMSCs 迁移依赖于不同细胞因子与其受体的结合，如基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）/CXC 趋化因子受体 4（CXC chemokine receptor-4，CXCR4）、干细胞因子（SCF）-c-Kit、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）/c-Met、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/VEGFR、血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）/PDGFR、单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）/CC 类趋化因子受体 2（C-C motif chemokine receptor-2，CCR2）以及高迁移率族蛋白 1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）/晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）等［27］。已有研究表明，低氧预处理 BMMSCs 有利于干细胞的迁移。Annabi 等［28］研究发现，低氧微环境可以快速诱导BMMSCs 的迁移，并且可以降低基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达及分泌，明显提高膜1 型 MMP（membrane-type1-MMP，MT1-MMP）的表达，提示低氧可通过促进 BMMSCs 表达 MT1-MMP 提高其迁移能力。Liu 等［29］研究发现，低氧可诱导 BMMSCs 低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表达，后者作用于下游基因 VEGF 和 SDF-1α，促进 BMMSCs的迁移。多项研究同样认为低氧可能通过上调 SDF-1α、CXCR4、RhoA 或 HIF-1α 的表达从而促进 BMMSCs 的迁移［29-31］。

4　低氧对 BMMSCs 分泌能力的影响

早在 1963 年就有研究发现，BMMSCs 可以合成细胞因子、生长因子等释放到微环境中发挥对其他细胞的调节作用［32］。大量文献表明，短期低氧预处理 BMMSCs 可以促进 VEGF、HGF、PDGF、bFGF 等表达，从而发挥促进血管生成的作用［33-35］。Hu 等［36］研究发现，低氧可以促进血管生成素 1 及促红细胞生成素等微血管形成相关因子的表达。另外，还有研究表明低氧可以促进 BMMSCs 分泌肿瘤坏死因子 α、IL-10 等炎性因子［37］，IL-10 可以抑制心肌缺血缺氧条件下心肌纤维母细胞增殖以及胶原蛋白的合成，从而发挥保护心肌以及抑制局部炎症反应的作用。Chen 等［38］将 BMMSCs 移植到小鼠心梗移行区，检测心肌促炎因子（IL-1β、IL-6、IL-8）以及抗炎因子（IL-10）的表达，结果发现在心肌缺血缺氧局部微环境下，BMMSCs 可以降低心肌促炎因子与抗炎因子的比率，从而发挥抑制局部炎症反应的作用。由此我们认为，低氧条件下 BMMSCs 的旁分泌功能明显高于常氧培养，细胞可分泌更多的血管生长因子、抗炎因子等活性物质发挥组织修复功能。

5　低氧对 BMMSCs 凋亡的影响

目前，BMMSCs 移植到缺血缺氧心肌局部后在数天内大量死亡也是干细胞治疗需要解决的重要问题［39］。Chacko等［34］以 0.5% 氧浓度分别预处理 BMMSCs 24、48 和72 h，发现低氧预处理 BMMSCs 可以抑制其凋亡，促进其存活、血管生成、分化等能力，并且低氧预处理 24 h 效果明显优于预处理 72 h。Maslov 等［39］研究显示，低氧预处理可以保护移植 BMMSCs 归巢到缺血心肌局部后的长期低氧及氧化应激反应所致的凋亡，从而发挥减少心梗面积、促进梗死后心肌重建等组织修复功能。

6　低氧对 BMMSCs 基因稳定性的影响

BMMSCs 的基因不稳定性是干细胞治疗安全性的主要问题，例如 BMMSCs 在体外扩增及进入体内后出现的染色体数目异常（非整倍体）、DNA 降解、端粒缩短等问题［40-41］。已有研究发现，常氧培养细胞可以导致 DNA 损伤从而导致细胞衰老及失去活力［17， 42-43］。Oliveira 等［44］研究发现，低氧可以迅速降低 DNA 损伤相关基因的表达及染色体数目异常，促进微卫星的不稳定性及维持端粒的长度。研究还发现，低氧不影响 BMMSCs 线粒体基因组的完整性。Fan等［45］同样发现，常氧（20%）条件下培养 BMMSCs 出现广泛的染色体异常，而低氧可以降低其氧化性损伤，联合抗氧化剂α-苯丁酰硝酮和 N-乙酰半胱氨酸可以进一步降低DNA 损伤及染色体异常，并可以促进 BMMSCs 的增殖。但是也有研究发现，被认为是肿瘤发生的主要因素的染色体数目异常，受供体影响而不是受培养环境中氧张力的影响［40］。

7　结语与展望

综上，低氧预处理（氧张力 0.5% ～ 5%）BMMSCs 可以作为一种有效方法在一定程度上克服 BMMSCs 的增殖缓慢、移植后迁移率低、基因不稳定等缺点，提高其临床应用的有效性及安全性，对再生医学的研究有至关重要的意义。另外，关于 BMMSCs 在低氧条件下的分化能力争议颇多，这可能与不同培养环境的氧张力、BMMSCs 的传代次数、细胞状态等有关。总之，虽然目前低氧对 BMMSCs 调控作用还缺乏一致性，特别是低氧对其分化能力的影响，但低氧对 BMMSCs 的生物学特性的影响及其在再生医学中的应用是不可忽视的。氧张力对细胞生物学行为的影响在一系列的影响因素中最为突出，且通过控制氧张力来影响细胞的生物学行为简单易行。但临床实践中仍有很多问题需要解决：①氧张力的最佳比例和最适培养时间的确定；②低氧对BMMSCs的调控机制是什么？其调节作用是否受传代次数及冻存后复苏的影响；③低氧预处理后，BMMSCs 体内致瘤性等问题。总之，低氧环境对 BMMSCs 生理特性及作用机制的影响研究具有重要意义，或可为解决缺血缺氧性疾病提供新的思路。

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·协会之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.011

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973 计划）（2012CB518205）；国家自然科学基金（81573086、31160219、31571231）

通信作者：格日力，Email：geriligao@hotmail.com

收稿日期：2016-01-12