血管性痴呆动物模型的研究概述

胥青梅，白 雪

血管性痴呆动物模型的研究概述

胥青梅，白 雪

血管性痴呆(VD)是由各种脑血管疾病引起的获得性智能损害综合征的总称。建立可靠的动物模型来模拟人类缺血性脑血管病的发病过程是研究VD发生发展机制及防治措施、疗效评价的关键。故建立一种重复性好、评价指标控制严格、便于操作和观察、符合不同实验研究目的的VD动物模型，一直是研究者们追求的目标。本研究对近年来常用的VD动物造模方法以及不同方法所造VD模型的应用进行简要综述，以期为今后的实验研究提供借鉴。

血管性痴呆；模型；血管阻断法；高脂血症；中医证型

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由脑出血、缺血或急慢性脑缺氧等脑血管疾病引起脑组织损伤，从而导致脑功能减退的一种智能障碍综合征[1]。在我国，VD的发病率和患病率不断增加，但其确切的病因病机至今仍未阐明，也缺乏特异高效的防治措施。因此，建立合理的VD动物模型对于深入探讨VD的病因、发病机制和研究新的治疗策略等均有重大意义。现将目前国内外VD模型的研究现状作一综述。

1 VD造模动物的选择

用于VD造模的动物应满足两个基本条件，一是其脑血管解剖结构特点和人脑相似，二是其神经系统和感觉运动系统应高度发达，对缺血缺氧等刺激能准确感知并迅速作出反应。鼠类动物不但非常符合这两个条件，而且具有较其他动物经济实惠、来源明确、易于饲养、便于操作、可控性强、生命力强等诸多优点[2]。因此，鼠是目前实验室制备VD模型最常用的动物。实验室鼠类造模动物包括大鼠、小鼠、沙鼠和豚鼠等多个品系。其中，以大鼠和小鼠的脑血管生理结构与人脑最为相似，均由颈动脉系及椎基底动脉系在脑底吻合，形成Willis动脉环，经此动脉环的分支共同完成脑的血液供应。大鼠和小鼠相比，大鼠具有体型相对较大，便于进行造模操作及造模后智能测试、行为学观察、影像学及电生理检查等优势，故成为VD造模最适宜的动物。

2 造模方法

目前国内外研究报道的VD大鼠模型制备方法包括血管阻断法、血管栓塞法、光化学法、去大脑皮层法、转基因法、立体定向内皮素-1颅内注射法、M-受体东莨菪碱颅内注入法等。其中以血管阻断法和血管栓塞法应用最为广泛。近年来，由于中医药特色疗法在临床VD治疗过程中优势凸显，部分研究者也开始探索一些与中医证型相关的VD造模方法。

2.1 血管阻断法 血管阻断法是指采用夹闭或结扎大鼠颈部动脉血管的方式以减少脑的血供，造成脑组织慢性缺血缺氧损伤。根据所阻断动脉血管数目的不同，血管阻断法可分为两血管阻断法(2-VO)和多血管阻断法(3-VO、4-VO)。随着研究的不断深入，许多研究者尝试将血管阻断法不断改良，并糅合了高脂血症、高血压、糖尿病等脑血管疾病的危险因素，以满足不同研究目的的需要。

2.1.1 两血管阻断法及改良 2-VO法是指分离出大鼠双侧颈总动脉后将其永久性结扎，造成脑组织慢性缺血缺氧损伤[3]。此法操作简便，重复性好，造模前后大鼠学习记忆能力明显降低，且不伴有神经功能缺损的症状，因此2-VO法被广泛用于各类慢性缺血性疾病所致的VD研究。该方法不足之处为一次性阻断了大鼠双侧颈总动脉，手术打击很大，术中大鼠死亡率高，术后难以长期存活，不利于观察。

王兴华等[4]对2-VO法改良，将同时结扎大鼠双侧颈总动脉改为间隔一星期分2次先后结扎大鼠两侧颈总动脉。由于减轻了一次手术的损伤程度，改良后的2-VO法显著降低了造模过程中大鼠的死亡率。在模型评价方面，吴章福等[5]通过比较传统2-VO法与该改良2-VO法所造VD模型的行为学和组织形态学指标，认为改良后2-VO法可以复制大鼠脑组织长期慢性灌注不足引起的VD模型，且与临床慢性脑缺血的病理过程更接近。由于改良2-VO法使VD模型大鼠术后存活率提高，因此该方法更加适用于药物起效慢、观察周期长的脑血管永久性闭塞的VD实验研究。

为了更好地模拟VD发病过程中反复慢性脑缺血再灌注损伤，王蕊等[6]先给大鼠腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg)，然后用动脉夹将大鼠双侧颈总动脉反复夹闭和再通两次，每次夹闭和再通时间均持续10 min。此法中使用硝普钠能降低大鼠血压，减少脑灌注，抑制了Willis动脉环的调节、代偿作用，提高了脑缺血再灌注损伤的可信度。术中无需结扎大鼠双侧颈总动脉，手术操作简单，对动物创伤小，术后易于恢复，存活率高，模型重复性、稳定性较好。但本法中硝普钠注射量对血压的影响及环境温度的变化都会影响造模效果[7]。

2.1.2 2-VO+高脂血症因素 王义义等[8]先用高脂饲料(由普通饲料78.8%+胆固醇1%+牛胆盐0.2%+蛋黄粉10%+猪油10%组成)喂养大鼠3周制备高脂血症大鼠模型，经鼠尾静脉采血确定大鼠体内血脂水平已升高(三酰甘油2.53 mmol/L±0.89 mmol/L)以后，再用传统2-VO法造模，制成高脂血症VD模型。造模30 d经电生理指标评价发现该法较传统2-VO法加重了大鼠海马区的短时程增强(STP)损伤，而对于长时称增强(LTP)没有显著性影响。此造模过程加入了高脂危险因素，适用于研究高脂血症与VD发病的关系及高脂血症合并VD的治疗等。

2.1.3 2-VO+糖尿病因素 宋莉莉等[9]将链脲佐菌素(STZ)以55 mg/kg的剂量注入雄性SD大鼠腹腔，导致大鼠胰腺的β-细胞破坏，3 d后由鼠尾静脉采血测血糖，将随机血糖持续>16.7 mmol/L者视作符合慢性糖尿病标准的大鼠，再对这些大鼠用2-VO法造模，制成糖尿病VD模型。此法模拟了VD发病中糖尿病危险因素，适用于研究糖尿病与VD发病的关系及糖尿病合并VD的治疗等。

2.1.4 2-VO+高血压因素 莫飞智等[10]先夹闭大鼠双侧肾动脉，复制出肾血管性高血压大鼠模型，再用2-VO法造模，制成高血压VD模型。此法模拟了VD发病中高血压危险因素，适用于研究高血压与VD发病的关系。

自发VD模型也被用来研究高血压与VD的发病关系。自发性高血压大鼠是一种人工培育的近交系大鼠。该品系大鼠具有稳定的高血压遗传性，一般在出生后3个月～4个月后即自然形成稳定的高血压，并进而出现包括高血压脑出血在内的多种并发症[11]。研究者可由这些高血压脑出血后存活下来的大鼠中筛选VD模型。自发VD模型与其他以正常大鼠为基础制作的VD模型相比，更好地模拟了在长期高血压基础上大脑持续低灌流致VD发病的这一病理生理过程[12]。但这类VD模型为高血压脑出血所致，与临床上大多数VD病人由脑缺血所致的发病机制不同[13]。

2.1.5 2-VO+多重复合危险因素 邵瑛等[14]选用“双肾一夹”法复制出高血压大鼠模型，1 周后开始以高脂饲料喂食20 d，筛选出高血压-高血脂(双高)模型大鼠，再用2-VO法复制出高血压-高血脂复合血管性痴呆(HH-VD)模型。该法在一次造模过程中同时考虑到多种VD发病的危险因素，旨在模拟临床老年病人基础疾病较多的情况下VD的发病病理生理过程。该方法对研究多重危险因素与VD发病的关系提供了新的思路。虽然与人类VD发病过程具有较高的相似度，但多种危险因素综合在一起，使研究过程中的不确定因素增加，降低了实验的可靠性。

2.1.6 多血管阻断法 传统的3-血管阻断法采用先电凝基底动脉再夹闭双侧颈总动脉制备VD模型。该方法能致大鼠脑组织迅速缺血，且缺血效果可靠，但在电凝基底动脉时，极易伤及延髓，操作难度大，手术创伤严重。Horecky等[15]将该法加以改良，首先结扎基底动脉，再反复夹闭和再通双侧颈总动脉，形成大鼠脑缺血再灌注损伤，经Morris水迷宫检测，证实此3-VO模型大鼠空间学习记忆能力的损害稳定，模型成功率高。该方法还可以通过控制颈总动脉缺血时间来控制大鼠脑缺血程度。Pusinelli采用先结扎大鼠双侧椎动脉，再可逆性夹闭双侧颈总动脉制备VD模型，即4-血管阻断法。此法导致全脑缺血，缺血后病理改变充分。但该方法操作复杂，且对大鼠脑组织血循环损害严重，动物死亡率高。杨晓妮等[16]在此法基础上进行改良，用直径约为0.5 mm的电凝针灼烧双侧翼小孔内的椎动脉，使之永久性闭塞，再可逆地反复夹闭和再通双侧颈总动脉。改良后的4-VO法避免了分离、结扎大鼠双侧椎动脉，操作更简单，损伤更小。多血管阻断法VD模型缺血迅速，缺血效果可靠，适用于研究急性脑缺血损伤。

2.2 血管栓塞法 血管栓塞法也是实验室制备VD模型的常用方法。血管内栓塞的栓子成分对于模型的成功率至关重要。研究者们在栓子成分的选择上也是做了诸多尝试。空气、纤维蛋白、血凝块、浮石、玻璃球、钢微球、罂粟籽、烟草籽、丝线、尼龙线、硅橡胶、石蜡、铁粉、金球、银球、花生四烯酸盐等均被报道用作制备VD模型的栓子。目前较常用的是血凝块、石蜡、铁粉和丝线。

2.2.1 注入血栓法 1982年由Kudo等将大鼠自体血凝块捣碎后筛选出直径小于100 μm的血栓栓子从大鼠一侧颈总动脉注入并结扎，此血栓注入法不仅造成了大鼠同侧皮质、海马和深部灰质的梗死，而且造成大鼠的认知功能损害。梅建勋等[17]将此法加以改进，先夹闭颈总动脉，将同种大鼠自体干燥血凝块研碎后筛选出直径小于200 μm的微粒制成栓子溶液，取0.3 mL由颈内动脉缓慢注入，注入时间不少于30 s，同时开放颈总动脉，使栓子随颈总动脉的血流进入颅内。在改良的血栓注入法中，栓子微粒直径的增大可以造成更为确切的脑梗死，血栓注入方式的改良更好地模拟了人体血栓入脑的过程，而栓子溶液量的减少则降低了造模动物的手术死亡风险。由于栓子进入颅内后停留的部位不固定，因此采用血栓注入法制备的VD模型梗死部位也不固定，梗死灶大小不好控制。

2.2.2 注入石蜡法 从大鼠胸骨左缘心跳最明显处进针(距中线约0.5 cm，进针0.5 cm～1 cm)，回抽见鲜血后将小剂量液状石蜡注入左心室，液状石蜡栓子随着血液循环进入颅内造成大鼠多发性脑缺血模型。研究表明向大鼠体内注入小剂量液状石蜡仅可使脑组织产生多发性梗死，而不会使其他器官发生缺血性改变。脑组织病理学检查发现此法所致脑梗死灶多发生在脑白质，呈多个岛样，部分大脑皮质及海马的神经细胞也会出现缺血性改变[18]。该方法避免了颈部手术，操作简单，创伤小，术后感染发生率低，适用于药物疗效等长期性观察研究。其不足之处在于栓子进入颅内后造成的梗死部位不确定。

2.2.3 注入铁粉法 注入铁粉法是在大鼠颅外安置小磁铁后由舌下静脉注入铁粉，通过磁铁的引导作用使铁粉聚集到指定区域，造成相应区域的脑血管栓塞。造模后大鼠通过行为学观察、电迷宫检测和分析类P3电位的变化，认为建立了可靠的VD模型。赵小贞等[19]就此法与2-VO法进行了对比，认为二法均可建立可靠的VD动物模型。注入铁粉法利用磁铁的引导很好地解决了传统栓塞法所制VD模型梗死部位不确定这一难题，同时还具有微创、易操作、模型重复性好等优点，但此法制备的VD模型脑梗死部位单一，与临床VD常为颅内多发病灶的特点存在一定的差异。此外，铁粉本身是否会对脑组织产生理化影响尚不明确。

2.2.4 大脑中动脉线栓法 尹军祥等[20]将尼龙线从颈内静脉插入后实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血，2 h后向外提拉线头使大脑中动脉再灌注，形成脑梗死模型。该法避免了开颅损伤，动物神经功能缺损严重，因此容易获得VD模型，成模率高。但该法受线栓的种类、线栓的制备方法、线栓的插入方法和入脑深度等因素影响较大[21]，对实验者操作要求较高，模型稳定性和重复性较差。

2.3 其他的西医造模方法 尚有光化学诱导法、去大脑皮层法、立体定向内皮素-1颅内注射法、M-受体东莨菪碱颅内注入法、转基因法等，但由于难以排除外源性干扰、手术创伤重、技术难度大、费用高昂等原因限制其科研大规模应用。

2.4 模拟中医证型的VD造模方法 为了进一步研究中医药对VD的防治作用，已有学者尝试做了模拟中医证型的VD模型研究。易亚乔等[22]运用“劳则耗气”的原理，对模型组大鼠经行为期3周的力竭游泳训练后采用2-VO法造模，由此认为建立了气虚血瘀型VD模型。万睿等[23]采用高脂乳剂连续灌胃大鼠15 d后再以2-VO法造模，即认为构建了脉络瘀滞型VD模型。这类中医证型的研究对于症候因素的控制是模型成功与否的关键。此外，由于缺乏有效的证型评价指标，中医的造模方法是否模拟了预期的证型尚待考究。

3 VD模型的评价方法

根据国际血管性行为与认知障碍学会的声明，VD的诊断需要考虑两个方面：一是确定存在认知功能障碍；二是确定血管疾病是引起认知缺陷的主要但非唯一的病因[24]。VD模型是否造模成功的评判自然也要从这两点出发。任何一个VD模型，只有同时满足存在认知功能障碍和认知功能障碍主要由血管损伤所致这两个条件，才能被认为是合格的。认知功能的检测主要包括动物的学习、记忆、避害、辨识能力，检测方法包括跳台法、避暗法、穿梭箱法、迷宫实验等，其中以Morris水迷宫应用最为广泛。血管损伤的检测包括如血沉、红细胞比容等血液流变学检测及损伤部位脑组织的病理学检测。造模前后海马区神经细胞的时程增强、凋亡情况及Bax、Bcl-2、Caspase-3、AVP、Aβ1-40等蛋白表达的变化情况均是常见的模型评价指标。模拟中医证型的VD造模方法目前尚缺乏有效的证型评价指标。

4 VD模型评价时间的选择

文献报道成模时间点在术后的3 d～28 d。孙洁荟等[25]通过比较分析造模术后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d大鼠模型海马神经元的组织病理学和超微结构变化，发现上述不同时间点大鼠海马CA1区神经元数量均显著减少，其中以术后14 d组海马CA1区神经元最少，超微结构显示神经元变性、核固缩最明显，此后随着侧支循环的建立，脑血流不断恢复，海马神经元数量开始增加，神经元损伤逐渐改善。因此，观察时间点应选择在造模成功后2周为宜。

5 小结与展望

VD造模方法种类繁多，各有优劣，目前尚无证据表明某种造模方法明显优于其他。研究者应综合考虑研究目的、实验环境、技术能力、经济情况等多个因素选择适当的造模方法。近年来，中医诊疗方法在临床VD的防治中优势凸显，研究显示中西医结合治疗对于病人自觉症状、精神神经症状改善以及提高长谷川痴呆量表(HDS)、日常生活能力量表(ADL)的评分均优于单纯西医治疗[26]。但中医治疗讲究分证论治，而目前国内外鲜有复制中医证候VD模型方法和相关证型评价标准的报道。而西医的造模方法经过大量研究，无论是在造模技术还是模型评价指标方面，均已较为成熟。因此如何在传统西医的造模方法基础上巧妙地融入不同中医证候要素，从而创建新的VD动物模型对研究VD的防治具有重大意义，这也是今后探索、努力的方向。

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(本文编辑郭怀印)

泸州医学院附属中医医院(四川泸州 646000)，E-mail：18228997050@163.com

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