人参皂苷Rg1对神经细胞衰老和衰老相关异染色质聚集的影响

韩知忖刘 冰周 辉

人参皂苷Rg1对神经细胞衰老和衰老相关异染色质聚集的影响

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目的探讨人参皂苷Rg1预处理对三丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的神经细胞衰老及异染色质聚集（SAHF）的影响。方法常规培养Neuro-2a细胞株，在造模药物刺激前，给予不同剂量的人参皂苷Rg1，同时设置模型对照组、正常对照组。进行细胞活力检测、衰老相关半乳糖苷酶染色、衰老相关异染色质聚集检测。结果人参皂苷Rg1预处理可改善t-BHP诱导的细胞活力降低，此改善呈剂量依赖性；人参皂苷Rg1预处理各组，SA-β-gal染色细胞阳性数呈剂量依赖性降低；人参皂苷Rg1预处理可预防t-BHP诱导的SAHF形成，呈显著剂量依赖性。结论人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地预防神经细胞衰老，防止异染色质聚集，有必要进一步研究。

Neuro-2a细胞；人参皂苷Rg1；细胞衰老；衰老相关异染色质聚集

随着老龄化不断推进，以帕金森病和阿尔采默病为代表的衰老相关神经变性疾病的发病率及致残率逐年升高[1]。细胞衰老（cellular senescence）参与帕金森病、阿尔采默病等神经退行性疾病的发生发展，并与氧化应激、端粒缩短等因素有关[2]。本文采用三丁基过氧化氢（t-BHP）制备Neuro-2a细胞衰老模型，考察人参皂苷Rg1预处理对神经细胞衰老及衰老相关异染色质聚集的影响，为阐明人参皂苷Rg1抗衰老机制提供可靠的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂 Neuro-2a（N2a）细胞株(上海远慕生物科技有限公司，批号YM-CS0050）；MEM基础培养基（Hyclone公司，批号SH30022.01B）；FBS胎牛血清（GIBCO公司，批号16400-044）；双抗（北京夏斯生物科技有限公司，批号SV30010）；t-BHP（阿拉丁，批号B106035-1L）；CCK8检测试剂盒（Dojindo公司，批号 CK04）；SA-β-gal检测试剂盒（Cell Signaling，批号9860）；H3K9me3抗体（Abcam，批号ab8898）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，批号P1110）；PBS（北京索莱宝科技有限公司，批号SH30256）；正常羊血清封闭液（北京索莱宝科技有限公司，批号SL2-10）；新鲜配制的3%H2O2；Triton X-100（Sigma，批号T9284）；人参皂苷Rg1（上海远慕生物科技有限公司，批号YM635B）；低速离心机（上海贝恩生物科技有限公司，批号TDZ4B-WS）；CO2培养箱（上海博讯，批号BC-J160S）；超净工作台（上海博讯，型号SW-CJ-2FD）；酶标仪（Thermo，型号MULTISKAN MK3）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组 参照文献[3]方法，取N2a细胞，常规培养，分6组处理如下：空白对照组：仅传代6代，不给予t-BHP处理；模型对照组：传代6代后，以100μMt-BHP处理；人参皂苷Rg1预处理4组：分别以 5μMRg1+100μMt-BHP、10μMRg1+100μMt-BHP、20μMRg1+100μMt-BHP、40μMRg1+100μMt-BHP处理，各组以相应浓度的Rg1EMEM培养N2a细胞，传代6代后用t-BHP处理4次，隔代作用1次，每次1h，末次作用后，换新鲜培养液培养24～48h后收获细胞。

1.2.2 CCK-8检测 参照文献[4]方法，取各组细胞，以5×103/孔的密度铺入96孔板内，每孔加培养液至终体积100μL，作用24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8反应液，孵育1～4h，用酶标仪在450nm处测定吸光度。

1.2.3 SA-β-gal染色 参照文献[5]方法，在六孔板中预先置入已铺多聚赖氨酸的1.8cm×1.8cm玻璃盖片，取各组细胞，按700/cm2的细胞密度接种，常规培养24h，次日取出盖片，用4℃ PBS冲洗细胞2次，4℃ 2%甲醛0.2% 戊二醛固定5min，PBS冲洗细胞2次；用SA-β-gal反应液37℃孵育3～4h，然后用双蒸水冲洗2次，后固定4min；冲洗，核固红染色细胞核，脱水，透明，封固。光学显微镜下观察、计数。

1.2.4 衰老相关异染色质聚集（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）检测 参照文献[6]方法，在六孔板中预先置入已铺多聚赖氨酸的1.8cm× 1.8cm玻璃盖片，取各组细胞，按700/cm2的细胞密度接种，常规培养24h，次日取出盖片，用4℃ PBS冲洗细胞2次，4℃ 4%甲醛固定15min，0.1%Triton X-100处理切片15min，使细胞固定且通透性增加，用PBS冲洗玻片，再用10%的胎牛血清封闭30min，然后滴加一抗（H3K9me3），常温孵育1h，PBS冲洗，滴加荧光二抗，常温孵育2～3h，PBS冲洗，加入DAPI染液复染，反应5min，PBS浸泡5min，清洗，晾干，加防淬灭树胶，激光共聚焦显微镜下观察H3K9me3在细胞核中的分布，以考察人参皂苷Rg1预处理对SAHF形成的影响。

2 实验结果

2.1 细胞活力 CCK-8检测结果显示，人参皂苷Rg1预处理可改善t-BHP诱导的细胞活力降低，且此种改善呈剂量依赖性，见图1（封四）。

2.2 SA-β-gal染色 人参皂苷Rg1预处理各组，SA-β-gal染色细胞阳性数呈剂量依赖性降低，见图2（封四）。

2.3 SAHF形成 人参皂苷Rg1预处理可预防t-BHP诱导的SAHF形成，呈显著剂量依赖性，其中尤以20μM、40μM效果最为显著，见图3（封四）。

3 讨 论

SAHF是衰老细胞特有的异染色质聚集现象，衰老细胞的核仁变大，DNA呈点状聚集分布，是细胞衰老的一个新的生物学标志。p16/Rb途径、组蛋白H2A变异体macroH2A、高迁移率蛋白A（HMGA proteins）、组蛋白甲基转移酶SUV39（诱导H3 Lys9 （H3K9）三甲基化）、组蛋白去乙酰化酶HDAC1等均参与SAHF的形成[7-8]。

人参是我国传统名贵中药，有抗衰老、抗氧化、益智及保护神经元免受毒性物质损伤等作用。人参皂苷Rgl对神经毒素诱导的帕金森病细胞及动物模型均有抗氧化作用。Rgl通过调节p16/Rb、p21、cyclin D等细胞周期调控因子表达等机制发挥其抗细胞衰老作用[9-11]。本研究结果提示，人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地预防神经细胞衰老，防止异染色质聚集。

本文采用t-BHP制备N2a细胞衰老模型，考察人参皂苷Rg1预处理对神经细胞衰老的保护作用，采用CCK-8评价Rg1对细胞活力的影响，采用SA-β-gal染色考察Rg1对细胞衰老的影响，并探讨Rg1 对SAHF这一较为新颖的细胞衰老分子生物学标记的影响。CCK-8测试结果提示，人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地改善t-BHP诱导的细胞活力下降；此外，随着处理时间的延长，不同剂量组之间的改善效果差异加剧，如在24h、48h，20μM与40μM两组吸光度值差异不明显，但在72h时，两者差异显著。SA-β-gal染色结果提示，人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性降低阳性细胞数，表明人参皂苷Rg1可预防模型药物诱导的细胞衰老，其中尤以40μM效果最为显著。SAHF染色结果提示，人参皂苷Rg1预处理可预防t-BHP诱导的SAHF形成，且呈显著剂量依赖性，其中尤以20μM、40μM效果最为显著。以上研究结果表明，人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地预防t-BHP诱导的细胞衰老与SHAF形成。鉴于SHAF为一较为新颖的细胞衰老干预靶标，有必要有针对性地深入探讨其作用机制，为人参皂苷Rg1的临床应用提供更多的科学依据。

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［11］Chen L，Lin Z，Zhu Y，et al.Ginsenoside Rg1 attenuates βamyloid generation via suppressing PPARγ-regulated BACE1 activity in N2a-APP695 cells［J］.European journal of pharmacology，2012，675（1）：15-21.

（收稿：2015-09-15 修回：2015-10-29）

Effects of Ginsenoside Rg1 on Senescent Nerve Cells and Senescence-Associated Heterochromatic Foci

HANZhicun1,LIU Bing2,ZHOU Hui3. 1 Department of Tuina,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012), China;2 Laboratory of Basic Medicine,Zhejiang Province Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310007),China;3 Department of Orthopedics,Hangzhou Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate whether ginsenoside Rg1 prevents oxidative-stress-induced cellular senescence and senescence-associated heterochromatic foci（SAHF）in Neuro-2a cells.MethodsSenescent Neuro-2a cells induced by tBHP（t-butylhydroperoxide）were treated in advance with ginsenoside Rg1.Healthy Neuro-2a cells and senescent Neuro-2a cells without ginsenoside Rg1 pretreatment serviced as controls.Senescence-associated β-galactosidase（SA-beta-gal）activity,cell viability and SAHF were examined.Results In a dose-dependent manner,ginsenoside Rg1 enhanced cell viability,decreased the number of SA-beta-gal positive cells,and decreased SAHF formation.ConclusionGinsenoside Rg1 protects Neuro-2a cells from tBHP-induced senescence and decreases SAHF.

Neuro-2a cells;ginsenoside Rg1;cellular senescence;senescence-associated heterochromatic foci

浙江省自然科学基金资助项目（No.Y2100169）

1浙江省立同德医院针灸推拿科（杭州 310012）；2浙江省中医药研究院基础实验所（杭州 310007）；3杭州市中医院骨伤科（杭州 310007）

刘冰，E-mail：gene112@163.com