重组人可溶性白细胞介素-4受体蛋白抑制大鼠哮喘研究

杨光勇 郭海涛 刘茜明 何光志 田维毅 蔡 琨 王 平 梁建东 王文佳 韩 洁

重组人可溶性白细胞介素-4受体蛋白抑制大鼠哮喘研究

杨光勇 郭海涛 刘茜明 何光志 田维毅 蔡 琨 王 平 梁建东 王文佳 韩 洁

目的探讨重组可溶性白细胞介素-4受体（IL-4R）对大鼠哮喘模型的影响。方法根据GenBank公布的Homo sapiens（human）IL-4R基因序列（XM_005255309），合成srhIL-4R基因片段，将合成基因片段插入pET-28a（+）构建重组表达载体pET-28a(+)-srhIL-4R，酶切鉴定后，将载体转入表达菌株BL21（DE3）进行诱导表达重组蛋白srhIL-4R，并用SDS-PAGE和Western-blotting方法分析重组蛋白。提取重组蛋白干预哮喘模型大鼠，取肺组织进行病理切片观察。结果重组载体pET-28a（+）-srhIL-4R酶切获得长度为500bp～750bp的目的片段，表达载体pET-28a（+）-srhIL-4R转入表达菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting方法可见重组蛋白分子量约为25kDa；重组人可溶性IL-4R蛋白干预哮喘大鼠可见肺组织炎细胞数量较模型组明显减少。结论srhIL-4R防治哮喘具有一定作用。

大鼠；哮喘模型；重组人可溶性白细胞介素-4受体；重组蛋白

白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）是参与哮喘发病的重要细胞因子，白细胞介素-4α链（IL-4Rα）的胞外结构域可溶性白细胞介素-4受体（soluble interleukin-4 receptor，sIL-4R）与白细胞介素-4（IL-4）具有高度特异结合能力，使得sIL-4R可以作为IL-4拮抗剂[1]。本研究由上海吉尔吉斯生物工程有限公司合成片段转入pET-28a（+）构建表达载体转化表达菌株BL21（DE3）表达进行诱导表达重组人可溶性白细胞介素4受体（recombinant soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R），提取srhIL-4R蛋白干预哮喘大鼠模型，旨在为下一步进行srhIL-4R治疗哮喘研究提供前期工作基础。

1 材料与方法

1.1 材 料 SPF级SD大鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司；实验动物合格证号：SCXK（渝）2012-0005；饲养条件：室温清洁屏障环境。灭活百日咳杆菌原液，购自北京天坛生物制品股份有限公司；氢氧化铝[AL（OH）3]、卵清蛋白（ovalbumin，OVA），购自北京索莱宝生物科技有限公司；超声雾化器，购自美久阳公司；DNA Marker DL2000、大肠杆菌DH5α，均购自上海生工；限制性内切酶（Nde I和Xho I），MBI公司产品；原核表达载体pET-28a（+），invitrogen产品；QIAquick胶DNA回收试剂盒，QIAGEN公司产品；一抗鼠抗srhIL-4R血清，由本实验室制备保存；羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联IgG，购自南京联科。

1.2 方 法

1.2.1 重组人可溶性白细胞介素-4受体（soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R）基因扩增与克隆 根据人可溶性白细胞介素4受体基因在Gen-Bank中公布的序列（XM_005255309），由上海吉尔吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R重组基因片段。合成序列采用PCR进行扩增，依据参照文献[2]扩增srhIL-4R基因引物，略有改动，srhIL-4R-Forward：5’-CGCCATATGCATGAAGGTCTTGCAGGAGC-3’（下划线表示Nde I酶切位点），srhIL-4R-Reverse：5’-CTCGAGCGGGTGCTGCTCGAAGGGCTC-3’（下划线表示Xho I酶切位点）。采取胶回收试剂盒回收目的片段，再连接pMD18-T克隆载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将DH5α铺于氨苄青霉素的固体LB培养基（含50mg/L）中，37℃培养12～16h。

1.2.2 构建重组载体pET-28a（+）-srhIL-4R 挑单个大肠杆菌DH5α菌落提取质粒DNA，用Nde I和Xho I进行双酶切并纯化回收srhIL-4R重组基因片段和pET-28a（+）载体，并进行胶回收目的片段，在16℃进行连接成重组载体pET-28a（+）-srhIL-4R，将连接产物转化感受态DH5α，涂在含有卡拉霉素的LB固体培养基（含50mg/L）平板中37℃培养18h。挑取单个菌落采用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定，将酶切为阳性菌落送生物公司测序。

1.2.3 表达重组蛋白srhIL-4R将测序正确的菌落进行抽提质粒pET-28a（+）-srhIL-4R 转化E.coli BL21（DE3）涂于LB含50mg/L卡拉霉素固体培养基中进行培养，挑取PCR鉴定为阳性的菌落到20mL 含50mg/L卡拉霉素，1mmol/L IPTG的液体LB培养液中进行诱导表达重组人可溶性白细胞介素-4受体(srhIL-4R)。

1.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 从37℃培养2～3h的菌液中取出1mL离心取菌体，加入180μL细菌裂解液（含PMSF1.8μL）重悬菌体，置于冰上30min，10 000×g，4℃离心15min，取上清和沉淀物加入适量的蛋白上样缓冲液煮沸5min，分别进行SDS-PAGE并进行考马斯亮蓝染色。

1.2.5 蛋白质印迹（Western-blotting） 确定srhIL-4R在菌体表达的最佳条件后再进行大量表达，提取表达产物并采用Ni柱纯化表达蛋白进行SDSPAGE，割取目的蛋白胶条进行半干式转印，取出硝酸纤维素膜条进行Western-blotting分析。采用0.01 mol/L PBS（pH=7.2）洗膜；加入包被液进行孵育，洗膜后加入一抗（鼠抗IL-4R血清，1：500稀释）进行孵育，洗膜后，加入二抗羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联IgG（1：8000 PBS稀释）进行反应，洗膜后加入显色液（TMB Substrate）进行避光显色，直到出现清晰条带后加蒸馏水中终止显色反应。

1.2.6 srhIL-4R干预哮喘模型大鼠 依据参考文献[3]，将60只SD大鼠随机为空白对照组、模型组、布地奈德西药组和重组蛋白srhIL-4R组，各15只。模型组、西药组和srhIL-4R组实验大鼠采用在腹部皮下三处注射10%OVA（含OVA 100mg、AL（OH）3100mg）与灭活的百日咳杆菌（5×109个/mL）的混合液1mL进行致敏1周，空白对照组在腹部皮下三处注射生理盐水1mL。共致敏2次，每次间隔1周，第2次致敏1周后进行激发。分别把模型组、布地奈德西药组和SrhIL-4R组的实验大鼠放入封闭的箱中，浓度为5%OVA用超声雾化器进行激发30min，持续10天；空白对照组用生理盐水进行雾化处理。

依据参考文献[4]，每次雾化激发前30min，对西药组大鼠腹腔注射0.5mL布地奈德稀释液，srhIL-4R组大鼠用0.5mL的IL-4R重组蛋白（1g/L）稀释液，空白对照和模型组大鼠分别注射0.5mL的生理盐水。最后一次激发4h后处死大鼠，取肺进行组织切片病理学观察。

2 结 果

2.1 PCR扩增与克隆 合成srhIL-4R基因片段用引物进行PCR扩增，经1.2%琼脂糖电泳得到在500bp～750bp之间的条带，与预期扩增片段长度相似，见图1（封二）。

2.2 酶切鉴定 pET-28a（+）-srhIL-4R载体经Nde I和Xho I双酶切鉴定得到500bp～750bp的目的片段，结果表明srhIL-4R基因片段已插入pET-28a（+）载体，见图2（封二）。选择双酶切鉴定为阳性菌落送生物公司测序，其测序结果与GenBank中公布的sIL-4R序列（XM_005255309）同源性达100%，提示srhIL-4R成功插入表达载体。

2.3 SDS-PAGE和Western-blotting分析 上清和沉淀物分别进行SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白主要以包涵体形式存在，纯化后进行SDS-PAGE发现表达蛋白大小接近25kDa，而含空载体的细菌沉淀物经诱导后无条带出现。割取目的胶条进行Western-blotting分析，发现含pET-28a（+）-srhIL-4R菌表达产物在大小接近25kDa出现条带，而空载体pET-28a（+）菌表达产物在大小接近25kDa没有出现条带，见图3（封二）。

2.4 IL-4R干预过敏性哮喘大鼠的病理观察 模型组大鼠出现呼吸加深加快，点头张口呼吸、毛色黯淡无光、反应迟钝、出现抓脸现象，听诊有哮鸣音；而正常组、srhIL-4R组和布地奈德西药组大鼠则正常。肺组织病理切片显示，正常组SD大鼠未见炎细胞浸润，肺泡大小正常见，见图4（封二）；模型组可见嗜酸性粒细胞、浆细胞和单核细胞等炎性细胞浸润，见图5（封二）；与模型组比较，srhIL-4R组和布地奈德西药组肺组织嗜酸性粒细胞、浆细胞和单核细胞等炎细胞数量明显减少，见图6～7（封二）。

3 讨论

重组蛋白是利用基因重组技术，重新排列目的基因，构建重组表达载体利用原核或真核表达系统以表达出来的具有目的基因特异性作用的蛋白，在生命科学领域有着极其重要的价值。IL-4是引起哮喘的关键细胞因子之一，sIL-4R是其拮抗剂，可以缓解或抑制哮喘的发生发展[5-6]，因此srhIL-4R重组蛋白表达的成功与否是本研究顺利进行的关键。本研究委托上海吉尔吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R基因片段转入pET-28a（+）表达载体转化表达菌株BL21（DE3）表达进行诱导表达。

肺组织中嗜酸性粒细胞、浆细胞和单核细胞等炎性细胞的大量浸润是哮喘发生时的特异性病理改变，且病理观察简单直观，故以此作为大鼠哮喘模型成功与否及药物布地奈德治疗和srhIL-4R重组蛋白干预哮喘模型的参考指标。

编码可溶性白细胞介素-4受体蛋白基因（IL-4Rα）在哮喘的发病中有着不可忽视的作用[5]。当IL-4Rα链第 576位谷氨酰胺被精氨酸所代替（Q576R），而Q576R基因多态性能够选择性增强IL-4Rα链信号作用，从而加重哮喘症状[4]。已经证实人类IL-4Rα单克隆抗体在治疗重症哮喘方面体现出了一定的效果[7]。重组蛋白较之单克隆抗体具有更强的治疗作用及更少的副作用，且稳定性更强。

本研究结果显示，srhIL-4R组大鼠嗜酸性粒细胞等细胞数量较模型组明显减少，进一步证实，本次实验成功表达的活性srhIL-4R重组蛋白在预防和治疗哮喘中具有一定作用，为哮喘患者的临床免疫靶向治疗提供一定的前期工作基础，具有较大的参考价值。

［1］Zavorotinskaya T，Tomkinson A，Murphy JE.Treatment of experimental asthma by long-term gene therapy directed against IL-4 and IL-13［J］.Mol Ther，2003，7（2）：155-162.

［2］张勇，王渭池，李元.人可溶性白介素-4受体（sIL-4R）在大肠杆菌中的表达和纯化［J］.中国生物化学与分子生物学报，2004，20（6）：778-784.

［3］龚萍.大鼠哮喘模型的改良与评价［D］.中南大学，2010.

［4］Taehdjian R，Mathias C，Alkhatib S，et al.Pathogenicity of a disease associated human IL-4 receptor allele in experimental asthma［J］.J Exp Med，2009，206（10）：2191-2204.

［5］杨光勇，郭海涛，何光志.白细胞介素-4及其受体的研究现状［J］.浙江中西医结合杂志，2014，9（24）：843-845.

［6］张婉莹，姜晓峰，梁红艳，等.支气管哮喘的细胞因子治疗进展［J］.国际免疫学杂志，2012，35（1）：64-66.

［7］Nishikubo K，Murata Y，Tamaki S，et al.A single administration of interleukin-4 antagonistic mutant DNA inhibits allergic airway inflammation in a mouse model of asthma［J］. Gene Ther，2003，10（26）：2119-2125.

（收稿：2015-11-07 修回：2015-12-23）

Recombinant Soluble Human Interleukin-4 Receptor Protein Inhibiting Rat Asthma Model

YANG Guangy-ong,GUO Haitao,LIU Ximing,HE Guangzhi,TIAN Weiyi,CAI Kun,WANG Ping,LIANG Jiandong,WANG Wenjia,HAN Jie. Department of BasicMedical Sciences,Guiyang Collegeof Traditional ChineseMedicine, Guiyang(550002),China

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant soluble human interleukin-4 receptor（srhIL-4R）in the asthma model.MethodsThe Homo sapiens（human）interleukin-4 receptor gene was synthesized according to the sequence of the GenBank（XM_005255309）,the synthesis of gene fragment was cloned into pET-28a（+）vector to construct the recombinant expression vector pET-28a（+）-srhIL-4R.The expression plasmid was induced into E.coli BL21（DE3）and expression strain was selected,the recombinant was analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting.Rat using an ovalbumin（OVA）-induced model of allergic asthma was conducted with the recombinant soluble human interleukin-4 receptor proteins,and lung tissue from model of allergic asthma was taken for pathology observation.Results500bp-750bp target fragment was obtained by restricted enzyme,SDS-PAGE and western-blotting analysis results of the recombinant protein was about 25 kDa.Compared with model group,allergic asthma intervention decreased significantly in inflammatory cells.ConclusionSrhIL-4R has a certain effect in the prevention and treatment of asthma.

rat;asthma model;recombinant soluble human interleukin-4 receptor;recombinant proteins

2011年贵州省社会发展科技攻关项目[No.黔科合SY字（2011）3020]；2014年度贵阳中医学院“2011协同创新中心”和贵州省委组织部高层次人才科研条件特助经费项目（No.TZJF-2011年28号）

贵阳中医学院基础医学院（贵阳 550002）

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com；Tel：13809430436