蛋白质组学在结核性胸腔积液诊断中的现状及进展

黄迪希 谭守勇 刘志辉



蛋白质组学在结核性胸腔积液诊断中的现状及进展

黄迪希 谭守勇 刘志辉

蛋白质组学的快速发展，为研究更快速、准确、简单的诊断结核性胸腔积液(tuberculous pleural effusion,TPE)的方法提供了技术及理论基础。作者回顾了当前主流的蛋白质组学相关技术及近年来结核病及结核性胸腔积液相关蛋白质组学的研究。指出，目前仅在结核性胸腔积液中表达的特异性蛋白尚未确定，但从结核病患者血清、胸腔积液等体液中能分析出较非结核性疾病患者体液的差异性蛋白，有望通过蛋白质谱的比较分析，寻找到结核性相关特异性蛋白，进而发现新型结核性胸膜炎诊断标志物。

蛋白质组学； 胸腔积液； 结核/诊断

蛋白质作为生命活动的重要物质基础，多年来一直是生命科学的研究热点。1994年澳大利亚学者Wilkins 和Williams提出了蛋白质组的概念，即“一个基因组或一个细胞、组织在特定时间及空间上表达的全部蛋白质”[1]。蛋白质组学则以基因组转录而成的所有蛋白质为研究对象，动态分析蛋白质在时间和空间上的变化，了解蛋白质之间的相互作用与联系。蛋白质的表达具有时间和空间的特异性，蛋白质数量可能是其基因数量的数十倍甚至百倍以上[2]，因此对蛋白质数量及种类的分析将是蛋白质功能研究的巨大挑战[3]。

结核分枝杆菌每年使全球数以百万计的人口罹患结核病,而结核病在全球导致死亡的感染性疾病中排名第二,仅次于人类获得性免疫缺陷综合征[4]。结核性胸膜炎是仅次于淋巴结结核的最常见的肺外结核病，常伴有胸腔积液的产生，但因产生胸腔积液的原因复杂，如恶性肿瘤、肺炎、结核病、免疫系统疾病、肺栓塞、心衰、肝肾疾病等[5-6]，使胸腔积液的归因诊断艰难。目前,结核性胸膜炎的确诊依赖于胸腔积液、胸膜组织涂片或培养以发现结核分枝杆菌，或者胸膜活检病理发现典型的结核肉芽肿，但阳性检出率均较低；通过单纯的胸腔积液分析,只有约1/3 的结核性胸腔积液(tuberculous pleural effusion,TPE)可以确诊[7]。因此，需要探寻新的实验诊断方法以提高临床诊断水平。众所周知,TPE中有着很高的蛋白质浓度，有学者认为可能是结核分枝杆菌的感染引起机体发生迟发型超敏反应，刺激机体产生的特异性免疫蛋白。尽管国内外已经有很多关于胸腔积液蛋白质组学的研究报道,但是TPE与非结核性胸腔积液中蛋白质种类及含量的差异以及它们在胸腔积液鉴别诊断中的作用仍不是很清楚。笔者对目前常用的蛋白质组学相关技术及近年来关于结核病及TPE蛋白质组学的研究综述如下。

一、蛋白质组学研究技术进展

目前，蛋白质组学研究的三大基本支撑技术为:双向电泳技术(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laseresorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。通过2-DE将蛋白质进行分离纯化，再通过质谱鉴定电泳图谱得到参数，便可找到与参数对应的蛋白质。1975年O’Farrell[8]建立的双向凝胶电泳技术是最经典的蛋白质组学技术，双向荧光差异凝胶电泳是改良的凝胶电泳技术，该技术克服了双向凝胶电泳技术无法消除不同图谱间差异的局限性，增强了结果的可重复性和可靠性[9]。但是该技术具有操作复杂和敏感度不高的缺点，且对分子量过小、极酸性和极碱性蛋白的分离较为困难，是其技术瓶颈。20世纪80年代末 Fenn等[10]和Tanaka等[11]发明的质谱分析方法大大推动了蛋白质组学的发展，近年来发展的SELDI-TOF-MS是新兴的蛋白质组学研究技术，它可直接检测原始样品，具有高通量、高敏感度和高特异度的特点[12-13]，但不能对检测出的蛋白质进行直接鉴定，所以还有待进一步发展。此外，鸟枪法蛋白质组学技术的发展，弥补了传统蛋白质组学技术的缺陷，并逐渐成为蛋白质组学主流技术[14-15]，该方法不需要双向凝胶分离过程，其显著优点是可以利用液相色谱将混合物各组分浓缩至很小体积，直接进入质谱检测，提高了检测的敏感度和动力学范围，其原理简单、操作方便和重复性好，可用于各种蛋白质混合物的蛋白质组学分析，如细胞、组织和各种体液等，因此，该方法一经出现便蓬勃发展起来。

二、结核性与相关鉴别疾病的胸腔积液蛋白质组学的研究进展

目前，主要是基于凝胶电泳分离的蛋白质组学技术筛选出差异性表达蛋白，这些蛋白质为筛选结核病特异性标志物及深入研究其发病机制提供了重要信息。

(一)TPE与其他疾病所致胸腔积液的蛋白质组学研究

国内外关于TPE与其他疾病所致胸腔积液的蛋白质组学研究不少。林全等[16]应用2-DE、SELDI-TOF-MS技术分析肺癌(20例)、结核性胸膜炎(10例)患者的胸腔积液，结果显示，肺癌性胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白质点52个，降低50%的蛋白质点60个。有9个点仅在TPE中表达，11个点仅在肺癌性胸腔积液中表达，并通过肽指纹图谱分析成功鉴定了6个蛋白质。肺癌性胸腔积液组与TPE组的双向电泳结果显示蛋白表达图谱有明显差异，这些差异蛋白可能是肺癌相关蛋白或肺癌特异性蛋白标志物。Wang 等[17]应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术分析肺癌(10例)、结核性胸膜炎(6例)和肺炎(4例)患者的胸腔积液和血清，发现20种差异表达蛋白，并鉴定出16种蛋白质，这些蛋白质与铁代谢、炎症免疫反应及凝血机制等相关，其中血红素结合蛋白、纤维蛋白原-γ和甲状腺素运载蛋白在TPE及血清中呈低表达，血清淀粉样P成分在TPE中呈高表达，但在血清样本中未见差别，JMJD5蛋白在恶性胸腔积液、肺癌组织及癌细胞中呈低表达，上述蛋白质有望成为鉴别结核性与癌性胸腔积液的候选标志物。该研究结果还提示，胸腔积液联合血清检测有可能成为一种有价值的研究工具，但需要大样本临床试验加以验证。Zhang 等[18]在2015年通过对20例TPE、17例恶性胸腔积液、13例漏出液进行2-DE、MALDI-TOF-MS和指纹图谱分析，随后通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库分析差异蛋白，结果发现5个特征性蛋白：补体C1抑制物(C1-INH)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、补体C3b、铜蓝蛋白(CP)、Z34c蛋白碎片Fc(Z34c-Fc)。其中C1-INH在TPE中呈高表达，在恶性胸腔积液中低表达，TTR、C3b则相反。综合上述的各种研究，其方法均使用经典的蛋白质组学实验方法并辅以先进的鉴定技术，但各项研究所鉴别出来的“特异蛋白”的数量和种类不尽相同。使许多有意义的蛋白未予发现。归纳重复性欠佳的原因，可能有以下原因：(1)样本量少；(2)样品处理方法不尽相同；(3)软件分析存在一定的主观性。但这些前期资料的积累，为日后此方面蛋白质组学的研究提供了重要基础。如何解决重复性低的问题，是今后研究TPE特异蛋白的重要攻克目标。

(二)良性与恶性胸腔积液的蛋白质组学研究

虽然很多良性与恶性胸腔积液同为渗出液，但治疗方法及预后相差甚远，恶性胸腔积液常常成为TPE鉴别时首先想到的疾病。肺癌作为一种较为常见但预后欠佳的呼吸系统恶性疾病，其引起的恶性胸腔积液与其他疾病引起的良性胸腔积液的早期鉴别显得尤为重要。直接对肺癌患者和良性疾病患者的胸腔积液进行蛋白质表达差异分析，是通过非损伤途径识别肿瘤标志物的更佳途径，其敏感度及特异度明显优于血浆和血清途径检测[19]。Li等[20]运用纳米液相色谱分析，通过对非小细胞肺癌和TPE的对比研究，发现了白介素-1α在非小细胞肺癌组高度表达，并通过酶联免疫吸附细胞法鉴定证实，对非小细胞肺癌所致胸腔积液的蛋白质组诊断有着重大价值。除此之外，对恶性胸腔积液整体的蛋白质组研究也有不少。侯伟健等[21]进行了肺癌与良性胸腔积液蛋白质双向电泳图谱差异分析，结果显示两种胸腔积液电泳图谱平均匹配点数为(286±14)和(298±21)，匹配率87.7%和86.9%，差异蛋白质点82个，其中37个在肺癌胸腔积液中高表达，24个在肺癌胸腔积液中低表达；有17个点仅在良性胸腔积液中表达，4个点仅在肺癌胸腔积液中表达，表明二者存在一些表达差异蛋白质，其中有的为潜在的恶性胸腔积液特异蛋白，但未能鉴别为何种蛋白。岳倩宇等[22]在2014年同样对结核性、恶性和漏出性胸腔积液的相关蛋白质进行二维凝胶电泳图谱识别、鉴定，发现甲状腺素三级结构A链和补体C3b在恶性胸腔积液中高表达，在漏出液中低表达。以上研究均表示在恶性胸腔积液与良性胸腔积液(包括各种原因引起的的渗出液、漏出液)中，可通过蛋白质组学技术分析出差异蛋白。但笔者认为，良性胸腔积液的定义范围较广，通过蛋白组学鉴别难以获得技术支持，故此实验并不能作为最重要的鉴别诊断项被采纳。但上述实验依旧能为结核性与恶性胸腔积液的蛋白质组学研究提供线索。渗出性胸腔积液与漏出性胸腔积液生成的机制不同，内含蛋白的数量和种类也不相同，鉴别相对容易，而各种渗出性胸腔积液间的鉴别诊断就比较艰难，因此TPE在蛋白质组学分析上应侧重于与其他疾病导致的渗出液作对比。

(三)结核性胸腔积液与血清相关蛋白质组学研究进展

有文献[23]报导，采用弱阳离子交换蛋白质芯片(WCX2)处理分析样本、应用SELDI-TOF-MS技术，以蛋白质/多肽质荷比(m/z)区分不同的蛋白质/多肽，对5例结核性胸膜炎患者血清与胸腔积液蛋白质组进行描述性分析，结果显示：(1)在5例患者血清中检测到134种血清蛋白质/多肽，其中76种在胸腔积液中未出现：在5例患者胸腔积液中检测到269种蛋白质/多肽，其中211种在血清中未出现。(2)在5例患者血清中均检测到m/z分别为2660、3191、4208、5903、7764、9287等6种蛋白质/多肽；在5例患者胸腔积液中均检测到m/z分别为2416、2660、2900、2940等4种蛋白质/多肽；在5例患者血清和胸腔积液中均检测到m/z为2660的蛋白质/多肽。该研究结果还显示：TPE蛋白质/多肽种类约为血清蛋白质/多肽的2倍，这就充分证明TPE并非简单的胸膜毛细血管渗透液的积聚，由结核分枝杆菌侵袭胸膜所致的病理性蛋白质/多肽在TPE的蛋白成份中占有较大的比例，从理论上推测，我们可以从中找到诊断结核性胸膜炎的特异性标志物。有研究表明[24-25]结核病患者有其特定的血清蛋白/多肽指纹谱型。因此，结核性胸膜炎患者的血清蛋白质组亦值得深入研究，对其进行深入研究有助于明晰结核性胸膜炎的发生机制和检测到诊断标志物。但该研究也提示结核性胸膜炎患者胸腔积液蛋白质组远比其血清蛋白质组复杂，又因样本量小，不能进一步深入研究以探索结核性胸膜炎患者胸腔积液与血清蛋白质组学差异问题。 2014年刘志辉等[26]应用SELDI-TOF-MS技术检测5例结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌分离株Middlebrook7H9液体培养早中期(7 d与14 d)培养滤液及患者血清、胸腔积液蛋白质组，并进行描述性比较分析，结果显示，4例患者胸腔积液蛋白质组蛋白质种类和数量均多于血清蛋白质组，所有患者培养滤液、胸腔积液、血清中均存在相对分子质量为2660的蛋白质，这初步表明相对分子质量为2660的蛋白质具备结核性胸膜炎特异性体液蛋白质标志物的表征，但尚需大样本量进一步予以研究证实。2006年Agranoff等[24]首次应用SELDI-TOF-MS技术分析了179份活动性结核病患者和170份非结核病对照组(包括易与结核病混淆的疾病149例及健康对照21例)的血清蛋白指纹图谱，通过支持向量机获得最佳分类模型以区别结核病与非结核病，其敏感度为93.5%，特异度为94.9%，准确度为94.2%。通过支持向量机还获得由20个具有鉴别意义质谱峰构成的分类模型， 其诊断准确度达到90%，应用MALDI-TOF-MS技术鉴定其中2个具有意义的标志物，其中血清淀粉样物质A蛋白是在结核病中呈高表达的阳性蛋白标志物，且是急性期蛋白质，是许多炎症反应性疾病(包括结核病)处于活动期的标志物；甲状腺素运载蛋白是在结核病中呈低表达的阴性蛋白标志物，目前已被研究者证明存在于结核病患者的血清、胸腔积液和脑脊液中，其潜在价值及与结核病的相关性值得深入研究。

三、胸腔积液蛋白质组学研究的展望

胸腔积液蛋白质组学研究为结核性胸膜炎的诊断带来了新的思路和广阔的应用前景，但目前该方向研究还具有一定的局限性，一方面，研究对象中对照组病例(包括易与结核病混淆的疾病及健康对照)需要慎重选择，临床上常选择与结核性胸膜炎相似的疾病进行鉴别，因此在寻找胸腔积液蛋白标志物时，需谨慎地进行实验对象设计，将所有可能混淆的疾病都列入比较， 是疾病标志物研究成功的关键；另一方面，虽然国内外此方面研究不少，但受限于诸多因素，实验方案设计不尽完善，如仅使用一种pH范围IPG胶条和一种蛋白质捕获芯片进行体液蛋白质组研究而未能研究其蛋白质“全谱”；再有样品中往往90%的蛋白质是高丰度蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白等，这些高丰度蛋白影响到分子量相似的低丰度蛋白的检测[27]，许多低丰度蛋白含量极微，为pg级，而正是一些种类繁多、性质各异的低丰度蛋白和相对分子质量较小的蛋白，能带给我们十分重要的信息，而应用双向电泳研究血清蛋白质组可能未考虑高丰度蛋白的去除对低丰度蛋白检出的严重影响，因此蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤[28-30]，随着蛋白质组学样品处理技术的突破性发展，将会推动双向凝胶电泳分离技术和质谱鉴定技术在蛋白质组学研究中发挥更显著的作用[31]。当前对结核病血清、胸腔积液、脑脊液、结核分枝杆菌分泌蛋白等蛋白质组学的研究仅停留在整体性描述阶段，对初现曙光的目标蛋白质尚缺乏深入研究(如蛋白质来源、蛋白质鉴定、生物学特性研究等)；而且许多研究所取得的成果往往缺乏大规模的临床应用来验证，小规模蛋白质组学实验获得的候选标志物，必须经过更大的样本验证，才能确定哪些变化是TPE所特有。

综上所述，目前所采用的蛋白质组研究技术主要集中在SELDI-TOF-MS和基于凝胶电泳的传统蛋白质组学技术，这些技术都存在自身的局限性，相对具有技术优势的鸟枪法蛋白质组学研究还比较少。但是，随着蛋白质组学的不断发展，这些前期的不断尝试与探索，逐渐会弥补自身所存在的不足，不断发展为高分辨率、高敏感性和高通量的蛋白质组学技术，将会有越来越多的胸腔积液蛋白质标志物被发现，胸腔积液蛋白质组学的研究必将会为结核性胸膜炎诊治方面发挥重要作用。

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(本文编辑：孟莉 范永德)

The present situation and progress of proteomics in the diagnosis of tuberculouspleural effusion

HUANGDi-xi,TANShou-yong.

Divisionoftuberculousis，GuangzhouChestHospital,StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email:tanshouyong@163.com

The rapid development of proteomics has provided technical and theoretical basis to study more rapid, accurate and simple method of tuberculous pleural effusion.This article reviewed the current mainstream of techniques for the proteomics and the proteomic research of the tuberculosis and tuberculous pleural effusion in recent years.The analysis indicates that the special protein only expressed in tuberculous pleural effusion have not been found so far.However,the difference protein can be analyzed from TB patients serum and pleural effusion to the control group.From these difference proteins, the tuberculous pleurisy related specific proteins will be found by the protein mass spectrometry analysis.Furtherly we hope to seek found e new tuberculous pleurisy diagnostic markers.

Proteomics； Pleural effusion； Tuberculousis/Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.005

广州市科技计划项目(2014Y2-00117)

510095广州市胸科医院肺结核科 呼吸疾病国家重点实验室[黄迪希(广州医科大学在读研究生)、谭守勇、刘志辉]

谭守勇，Email：tanshouyong@163.com

2015-12-23)