代谢组学在结核病诊疗和病原学研究中的应用

孙琳 申阿东



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代谢组学在结核病诊疗和病原学研究中的应用

孙琳 申阿东

代谢组学作为对机体的动态代谢状态进行定量测定的技术，可用于对代谢谱和代谢通路动态的分析、寻找疾病相关的生物标志物、测定机体内药物引起的代谢改变、探寻疾病发病机制。近年来，代谢组学已开始被应用于结核病的诊断、治疗、病原学、发病机制等方面的研究中。因此，作者对代谢组学在结核病诊疗和病原学研究领域的进展进行综述，并初步探讨其在临床应用和研究中的重要意义。

代谢组学； 结核病； 诊断； 治疗； 发病机制

结核病是由Mtb感染引起的传染性疾病。Mtb作为一种细胞内寄生菌，可通过影响宿主细胞的代谢进而导致宿主的器官、组织及各系统出现代谢紊乱。作为一种慢性消耗性疾病，结核病患者往往表现为能量和代谢失衡，即分解代谢加强、能量消耗增高，如蛋白质分解代谢增强、胸腔积液、腹腔积液导致的蛋白质丢失等均会导致机体出现负氮平衡。代谢物作为生物体功能的中间产物和终末产物，可直接反映机体基因和蛋白质水平的变化，病理及外界刺激等因素导致的生理改变[1]。近年来，代谢组学逐渐被用于结核病的研究中。笔者对代谢组学在结核病的诊断、治疗、病原学、发病机制方面的研究进行综述，初步探讨其在结核病研究中的重要意义。

代谢组学在结核病诊断和治疗中的应用

一、结核病新型诊断标记物的筛选研究

结核病的有效控制有赖于疾病的早期发现和诊断。而目前结核病的诊断面临着一系列的困难，包括Mtb的培养周期长、抗酸染色的敏感度低等问题。为了弥补上述方法的不足，已有研究者采用代谢组学技术，通过筛选出的特异性代谢产物建立结核病诊断的新方法。国内外多个研究团队分别采用磁共振成像(MRI)技术、气相色谱-飞行时间质谱联用技术(GC-TOF MS)、超高效液相色谱-质谱仪联用技术(UPLC-MS)等对活动性结核病患者血清、血浆等体液标本的代谢谱进行分析[2-6]。其研究策略除了选取有统计学差异的代谢物建立诊断模型，并评价其诊断准确性[计算诊断指标的敏感度和特异度、受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积等]外，还包括通过旁路分析和富集分析获得结核病患者出现紊乱的代谢通路。例如，有学者研究发现，结核病患者在氨基酸、脂质分解代谢和糖酵解途径出现不同程度的紊乱[2-3]；将代谢物浓度与疾病亚型进行分析，发现了可能与结核病患者肺组织的病理损伤相关的血清代谢物等[4]。由此可见，代谢组学在结核病诊断中具有很好的潜在价值。上述研究对于深入理解疾病的发病机制及建立新的结核病诊断方法均具有很好的临床意义。

代谢组学可以对组织和循环系统中不同生理和病理状态下相对分子质量小于1000的内源性小分子代谢物的变化进行检测。这些代谢物在血液、尿液等体液标本及组织中化学性质较稳定，可被多种方法检测到。通过代谢组学技术平台获得结核病患者的代谢谱，不仅有助于筛选潜在的诊断标记物，而且对于明确疾病的进程、病情的发展变化可能均有一定的指示作用。

二、抗结核药物治疗的评价研究

早期治疗并合理用药是治疗结核病的关键。代谢组学可通过检测药物所引起的内源性代谢物的变化，以及通过药代动力学研究，直观地反映生物体在药物治疗过程中所出现的生理生化等变化，从而评价药物的临床治疗效果和安全性。代谢组学还可用于检测特定药物的代谢产物在患者体内的水平变化，并在临床症状和体征出现前及早监测药物毒性反应等，从而及时调整用药方案，有助于减少药物不良反应。代谢组学已开始应用于肿瘤的治疗和中药的治疗效果评价中[7-11]，在结核病中的研究仍然较少。Mahapatra等[12]通过分析不同治疗阶段患者体内的代谢谱变化，来监测随治疗时间而出现浓度改变的代谢物，明确结核病患者对抗结核药物的反应，以及监测抗结核治疗的临床效果。在新药研发研究中，Shimokawa 等[13]将碳核素标记的药物与血浆共培养，通过代谢组学检测药物的代谢和降解产物，从而有助于明确温度、pH值等因素对药物代谢的影响，以及确定药物在血浆中的半衰期、中间和终末代谢产物及其分子结构。另一项研究对药物敏感的结核病患者治疗前后的血浆代谢谱和外周血RNA表达情况进行分析，初步了解了机体内与结核病易感或抗结核药物治疗相关的固有免疫因素[14]。

代谢组学在Mtb细菌学研究中的应用

一、Mtb的病原学研究

代谢组学已被用于Mtb的鉴定、生长、增殖、免疫逃逸等方面的研究中。例如，在病原学诊断方面，采用代谢组学技术获得不同病原菌的代谢谱，并通过代谢谱的差异建立诊断模型，将Mtb同其他菌株区分开来，从而达到菌种鉴定的目的[15-16]。在Mtb免疫逃逸研究方面，Chuang 等[17]发现与Mtb在宿主体内潜伏相关的关键酶外切聚磷酸酶可导致Mtb生长受限和代谢水平降低，其功能缺陷可改变Mtb细胞膜的通透性、增加其对抗生素的耐受性，从而抵抗抗生素的杀灭作用。在Mtb生长增殖研究方面，Loots du[18]发现，由于rpoB基因突变导致了Mtb的mRNA不稳定性，进而使其能量产生和代谢障碍，最终影响细菌的生长。

二、Mtb与宿主相互作用机制研究

疾病的发生发展是感染的病原菌与宿主相互作用的结果。Mtb作为细胞内寄生菌，通过宿主-病原体相互作用导致宿主的能量和蛋白质代谢等的变化[19-20]，从而导致疾病或者炎症的发生。代谢组学逐渐被应用于研究Mtb和宿主免疫系统的相互适应性改变[21]和Mtb诱导的宿主免疫细胞应答等[22]。Singh等[22]对Mtb特异性抗原早期分泌靶蛋白6 (ESAT-6)影响宿主巨噬细胞表型分化进行了研究。该研究将细胞稳定状态的代谢物浓度与数学模型相结合，对糖酵解途径的反应速率进行预测和评估，有助于深入了解Mtb诱导巨噬细胞表型分化的机制。

三、Mtb药物作用机制研究

明确抗结核药物的作用靶点或代谢通路有助于研究抗结核药物的治疗机制和为Mtb的耐药机制提供新证据。体外实验研究常选用碳核素示踪法，将标记的体内小分子与Mtb共培养，通过监测碳核素在代谢通路中的“流动”而追寻抗结核药物可能的药物作用靶点[23]。另外，代谢组学技术在Mtb耐药的影响因素分析等方面也具有一定的应用价值，将利福平耐药、rpoB基因突变、Mtb的RNA聚合酶β亚基与脂肪酸代谢改变联系起来，将药理研究与代谢组学进行结合，从而有助于进一步了解Mtb的耐药机制[24]。在耐药机制方面的研究较多，Loots du[25]从代谢的视角揭示了katG基因的突变在Mtb耐药中的作用；Berney等[26]首次发现了Mtb无法清除宿主体内蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的中间代谢产物，从而导致细胞死亡的机制，为寻找快速杀灭Mtb的药物靶点提供了思路。

代谢组学研究的常用分析平台及发展的新策略

一、高通量代谢物检测平台

代谢组学的研究需要高通量代谢物检测技术和生物信息学技术的有机结合。目前常用的高通量代谢物检测平台主要有液相与质谱联用技术(LC-MS)、气相与质谱联用技术(GC-MS)、MR分子成像。LC-MS和GC-MS方法为集色谱高分离能力与质谱高敏感度和高选择性于一体的分离分析方法，具有敏感度高、样本选择范围广、可对样本进行定性和定量分析等优点，但缺点在于样本需要前处理和离子化、可供确定化合物结构的数据库有限、具有基质效应等。MR分子成像特点在于检测速度快、对样本无破坏性、样本处理简单、进样量少、重复性好、成本低等特点，但缺点在于敏感度低、样本选择范围小于LC-MS和GC-MS方法、检测动态范围有限、无法进行定量分析等。目前，上述3种检测平台各有优缺点，将上述方法有机结合、优势互补可有助于更全面的分析样品的代谢物组成变化，也是当前研究的一个发展趋势。

二、生物信息学数据分析平台

通过检测平台获取的复杂数据需借助后续的生物信息学平台进行分析和解读，从而进一步揭示海量信息中蕴含的生物学意义。常用的分析方法包括主成分分析(PCA)法、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交信号校正技术偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等。代谢组学检测到的是海量的多维数据，通过生物信息学分析，不仅可以有效简化数据结构、对未知代谢物进行鉴定、寻找用于疾病诊断的生物标记，而且可通过对代谢物的相关代谢通路进行筛查，进一步深入探讨差异代谢产物在机体代谢中的潜在作用。

三、代谢组学与其他技术平台整合的系统生物学研究模式

在后基因组时代，随着实验技术和计算机技术的整合和发展，让我们对疾病的认识有了一个根本的转变和提升，同时也促进了对疾病代谢网络的研究。系统生物学方法的核心是将各种组学数据整合并建立数学模型、实验验证、模型的优化等。结核病系统生物学研究的最终目的在于系统地分析宿主和病原体在感染过程中的相互作用，从整体和系统的角度全面分析疾病的发生发展机制。代谢组学作为继基因组学、蛋白质组学、转录组学之后新兴的系统生物学技术，将代谢组学与其他组学方法有机结合，建立系统的、综合水平的分析模型，有助于综合分析各种组分的交互作用，进一步加深我们对疾病的认识。

通量平衡分析(flux balance analysis,FBA)和代谢通量分析(metabolic flux analysis，MFA)作为结核病系统分析的模型之一，已被成功用于研究原核细胞在不同环境中的代谢状态。MFA为用计量矩阵模型模拟稳态下细胞内代谢反应的一种定量分析方法，可以对代谢特性进行精确的定量，从而有助于明确遗传和环境因素对生物的影响，以及对代谢的特定通路进行准确的分析。目前，MFA被用于分枝杆菌菌酸的代谢研究和寻找潜在的药物靶标[27]，以及将蛋白质组学与MFA进行整合研究细胞的代谢网络等[28]，以及采用改进的通量分析方法E-Flux-MFC研究环境和遗传因素通过基因表达进而对机体代谢的影响[29]。

Vashisht 等[30]在Mtb代谢组学和基因组学的基础上，建立了新型的代谢系统生物学图谱(systems biology spindle map of metabolism，SBSM)，并将其应用于寻找和预测药物靶标。研究者通过Mtb代谢系统生物学图谱的结果和代谢动力学建立模型，明确与Mtb生长和生存相关的关键基因，并对其药物作用的可能靶点进行预测。该研究将为新药的研发提供新的思路。Ma等[31]通过建立全基因水平的代谢调节代谢模型(probabilistic regulation of metabolism，PROM)，将Mtb参与基因调节的转录因子与代谢通路进行整合，用于模拟和预测转录因子敲除或过表达所引起的细胞代谢及生长状态的改变，从而有助于发现新的药物靶点，提高抗结核药物治疗效果。

展 望

代谢组学作为一种新型系统生物学研究方法，优势在于：(1)生物体基因和蛋白质层面的变化可通过下游的诸多代谢产物得以放大，从而使得这些变化更容易被检测到[32]； (2)可最直观地反映特定时间点上生物体内细胞的代谢状态[33-34]；(3)代谢物的种类远小于基因和蛋白质的种类[35]；(4)疾病的发生是机体蛋白质网络、基因调节网络和内环境稳态失衡所致，小分子的产生和代谢是这一系列变化的最终结果，可以最直接地反映机体的病理生理状态；(5)可对代谢产物进行准确的特征描述和精确定量[36]；(6)所需样本量少，且样本的预处理步骤简单、易操作[37]。

代谢组学采用高通量、高精确度的分析技术，对代谢产物进行精确的定量定性分析，从中筛选出具有统计学意义的潜在生物标记物，并将这些代谢信息与机体的生化反应、调控因素等信息进行有机结合，从而有助于研究者更好地了解环境和遗传因素对生物系统的影响。目前，代谢组学在结核病领域的研究工作仍然存在一定的困难和挑战。例如，如何对代谢产物进行全面分析，并从所检测到的众多候选代谢物中筛选出具有诊断价值的生物标记物仍是当前代谢组学的难题；如何与现有的诊断方法进行结合，有效地弥补现有诊断方法的不足；如何将不同的分析技术和信息生物学技术有机结合，优势互补，从而更好地诠释代谢物所传达的各种生物信息等。随着今后检测和分析手段的日益完善，代谢组学将极大地推动结核病的诊断、治疗及病理机制等的研究。

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(本文编辑：王然 李敬文)

Application of metabonomic technology in tuberculosis

SUNLin,SHENA-dong.

KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045,China

SHENA-dong,Email：shenad16@hotmail.com

Metabolomics, which is defined as the new quantitative measurement of the dynamic metabolic changes, has been used to analyze the metabolic profiling or network, detect the latent disease-associated biomarkers, characterize the metabolic response to a drug, or uncover the pathogenesis of different diseases. Recently, metabolomics techniques have been applied on several fields, including diagnosis, treatment, etiology and pathogenesis. This paper summarizes the research trends in diagnosis, treatment and etiology of tuberculosis and analyzed the significance of the metabolomics techniques in the process of its clinical application and research work.

Metabolomics; Tuberculosis; Diagnosis; Treatment; Pathogenesis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.004

国家科技重大专项(2013ZX10003003-004)；国家自然科学基金(81200064)；北京市重点实验室开放课题(2014NYJH02)

100045 首都医科大学附属北京儿童医院呼吸感染疾病研究室 北京市儿科研究所儿科学国家重点学科 教育部儿科重大疾病研究重点实验室 儿童呼吸系统感染性疾病研究北京市重点实验室

申阿东, Email：shenad16@hotmail.com

2015-10-16)