建立鼻咽癌标本库的经验和体会

陈超 潘建基 邹长棪 宗井凤 林可焴 何火聪 苏颖

科学研究是防治癌症的重要手段之一，而肿瘤标本则是研究恶性肿瘤的重要生物材料。在上个世纪末，一些发达国家已相继建成了较为完善的标本库。因此，在我国建立科学规范的标本库，长期有效地收集肿瘤标本是一项重要工作。鼻咽癌多发于福建、广东等沿海地区，研究鼻咽癌的发病机制，寻找相关标志物，有助于为患者制订个体化的治疗方案，而这一切必须建立在一个样品合格、信息完备且操作规范的鼻咽癌组织标本库基础之上，因此鼻咽癌标本库应运而生［1～4］。本研究利用我院鼻咽癌组织标本资源，初步建立了鼻咽癌组织标本库并取得了一定经验。现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 主要设备

液氮罐（180 L，Thermo公司）、-80℃超低温冰箱（forma 994）、净化工作台（SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司）和台式离心机（Thermo公司）等。

1.2 标本的采集和保存规范

我院鼻咽癌标本库成立于2012年4月25日，标本库接受本院医学伦理委员会的管理。在标本采集之前必须和患者或患者家属签署知情同意书（informed consent，IC）［5］。参照《肿瘤组织标本库常用实验技术手册》等相关资料，制定了组织标本的采集与保存规范等一系列标准化操作流程。组织标本的采集、保存等操作均严格按照相应标准化流程进行。

1.3 组织标本的采集

由经验丰富的鼻咽镜医生夹取鼻咽癌患者2份鼻咽癌组织标本，一份送病理科检查，确定是否为鼻咽癌组织；另一份作为标本库材料保存。鼻咽镜下取组织活检流程：先用1%呋麻液和2%利多卡因局部喷洒鼻腔及鼻咽部，或用蘸有麻黄素的棉签插入鼻腔以收缩鼻甲，然后用活检钳钳取约直径为5 mm的鼻咽病变组织。鼻咽黏膜血供为微小血管，组织出血量较少，很快可以自行止血，无需特殊处理；如果患者局部创面较大，出血较多，可将蘸有1%呋麻液的棉签插入鼻腔及鼻咽部进行止血，如果未能止血，则要考虑在三腔气囊导尿管引导下鼻咽填塞局部压迫止血。

标本库的组织标本，放入冻存管后立刻置于-196℃液氮中，防止RNA等生物分子的降解，此操作应在标本离体30 min内完成［6］，最后送到标本库，转移到储存液氮罐中长期保存［7］。

鼻咽部正常组织标本由志愿者提供，这些志愿者同样由经验丰富的鼻咽镜医生夹取2份鼻咽正常组织标本，一份送病理科检查，确定这些志愿者为非鼻咽癌患者。另一份作为标本库材料，其运输、保存条件同上。

1.4 血液标本的采集

采集鼻咽癌患者治疗前和治疗结束时的外周静脉血液，采血以患者晨起进食前为宜，血液标本共2管，1管为EDTA抗凝管，采血后立即将其上下颠倒数次，使抗凝剂与血液充分混匀；另1管为非抗凝管。每管抽取外周血液 10 mL［8，9］。

1.5 血液标本的分离与冻存

1.5.1 全血标本的分装 将EDTA抗凝管充分混匀，然后从中吸取1 mL的全血分装至5个EP管中，每管200 μL。并在 EP 管上标明“编号”“住院号”“全血”。

1.5.2 血浆的分离 全血标本以2000r/min离心5min，小心吸取上层血浆（为避免污染，弃去距离白细胞层5 mm以下的血浆）。每500 μL血浆分装一个EP管并标明“编号”“住院号”“血浆”。

1.5.3 白细胞层的分离 小心吸取白细胞层，并放入一个新的EP管中，尽量不要混杂血浆和红细胞，并标明“编号”“住院号”“白细胞层”。

1.5.4 血清的分离 将非抗凝血液以3 000 r/min离心5 min，小心吸取上层上清液，每500 μL分装一个EP管并标明“编号”“住院号”“血清”。

1.5.5 血液标本的冻存 每份血液标本可获得血浆和血清各3～5 mL，将全血、血浆、白细胞层和血清分别装入不同颜色的冻存盒中，并在冻存盒上标明编号，然后放入-80℃低温冰箱保存。以上所有操作必须在血液采集后4 h内完成［10］。

1.6 标本库数据库的建立

标本库的数据资料由医院的结构化电子病历系统和患者标本信息管理系统两部分组成［11］。本研究自行设计样本库信息管理系统，根据患者住院号、姓名等信息可以筛查到该患者的电子病历，并可进行样本的分类和统计等。

1.6.1 医院的结构化电子病历 我院采用海泰结构化电子病历，其内容包括患者基本信息、入院和住院资料、诊疗措施等。根据电子病历可以查询到患者住院病程、住院手术记录、住院医嘱、检验检查报告和电子病案库等信息。

1.6.2 患者标本信息管理系统

1.6.2.1 标本信息的录入 将标本内容包括标本编号、姓名、性别、出生年份、年龄、住院号、病区、床号、取材日期、收到标本的时间、体积、分装数量、是否配对、治疗前、治疗结束、是否凝血、是否溶血、病理号、病理诊断和备注等信息［12］录入计算机系统。

1.6.2.2 标本存放及使用信息的录入 标本存放信息录入的内容包括冰箱号、层号、架号、盒号和孔号等。此外，标本使用信息录入的内容包括标本取走时间、标本取走申请人、审批人、课题名称、课题负责人和经手人等。标本作为不可再生资源，一旦出库将不复存在［13］，因此标本的取用必须经过严格审核，标本的使用亦应严格按照标准化操作流程进行，做到标本资源使用的科学化和合理化。

2 结果

2.1 组织标本收集情况

目前标本库保存的鼻咽癌组织标本共1 152例。鼻咽部正常组织标本95例。鼻咽慢性炎症标本24例。

2.2 血液标本收集情况

目前已收集鼻咽癌患者全血标本、血浆标本、白细胞层标本和血清标本各2 416例。其中治疗前1 635例，治疗结束781例，治疗前和治疗结束配对499例。血液标本和组织标本配对614例，其中与治疗前、治疗结束的血液标本均配对者193例。

3 讨论

以往许多组织标本的收集总是随着某项课题研究的开始而开始，同时也随着该课题的结题而结束，这种做法一方面可能出现所收集的标本不能完全满足课题研究的需求，另一方面将不可避免地造成剩余标本的浪费。一个由专人负责、科学管理、长期保存的标本库有利于标本的可持续收集和使用，同时也使不可再生资源的标本得到了最大限度地保护［14］。

不同类型的组织标本宜存放在不同颜色的冻存盒中，以便于分类管理。ID-color 81格2英寸彩色纸冷冻盒是一款有5种颜色的冻存盒。我们建立的标本库，全血标本装在红色冻存盒，血浆标本装在黄色冻存盒，白细胞层标本装在白色冻存盒，血清标本装在蓝色冻存盒，组织标本装在绿色冻存盒。每天记录冰箱的温度变化，如果温度异常应及时汇报和处理。每周测量液氮罐中液氮的体积，如果液氮不足，应及时联系订购，补充液氮［15］。

肿瘤标本库的建立在促进各地肿瘤医院科研水平的发展方面起举足轻重的作用。鼻咽癌是我省常见肿瘤，福建省肿瘤医院作为三级甲等肿瘤专科医院，其放射治疗科作为福建省的重点学科，承担多项鼻咽癌的基础及临床研究项目，建立针对鼻咽癌单病种的标本库对于开展鼻咽癌研究非常重要。我们从2012年开始创办建立标本库，经过几年努力，目前鼻咽癌标本库已初具规模，可为鼻咽癌科学研究提供丰富的组织及血液标本，这对促进鼻咽癌研究的发展具有重要意义。

建立一个规范化、标准化、信息完善的高质量鼻咽癌组织标本库将为鼻咽癌发生、发展等机制的研究及临床医学研究提供服务平台。当前如何进一步完善各项标本库的管理措施，确保标本长期保存的质量，建立更科学的组织标本采集、保存和信息化管理体系是需要不断探索的课题，有关方面值得深入研究。

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