AMPK在肿瘤放射治疗中的作用

易光明， 冯艺兰综述， 黄建鸣， 郎锦义△审校

(1.西南医科大学， 四川 泸州 646000； 2.成都中医药大学，成都 611137； 3.四川省肿瘤医院， 成都 610041)

AMPK在肿瘤放射治疗中的作用

易光明1， 冯艺兰2综述， 黄建鸣3， 郎锦义3△审校

(1.西南医科大学， 四川 泸州 646000； 2.成都中医药大学，成都 611137； 3.四川省肿瘤医院， 成都 610041)

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase， AMPK)，是细胞能量代谢感受器，在维持细胞能量平衡中发挥重要作用，与肿瘤的发生发展有密切关系。活化的AMPK通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 抑制蛋白质合成、 激活细胞周期检查点如激活p53 及周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制因子p21cip1阻滞细胞周期进程，从而抑制细胞生长。近年研究发现，电离辐射在癌细胞中通过共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)激活AMPK并介导信号转导，活化p53-p21cip1信号并抑制 mTOR通路。并且，联合AMPK激活剂可调节肿瘤细胞的辐射敏感性。本文就AMPK信号通路在肿瘤放疗方面的最新研究进展进行综述。

腺苷酸活化蛋白激酶AMPK； mTOR； 肿瘤； 放射治疗

放射治疗是肿瘤治疗的三大手段之一，研究证明，70%的肿瘤患者在治疗中需要接受放射治疗。然而，由于肿瘤细胞复杂的生物学特性，容易产生原发或继发性放射线抵抗。寻找有效的途径改善射线抵抗是临床的迫切需求。最新的研究发现，活化AMPK可以增加肿瘤细胞放射治疗的敏感性。并且，作为调节能量代谢的一个重要感受器，AMPK可调控肿瘤细胞的“Warburg 效应”并通过介导多种信号通路抑制肿瘤的生长。本文就AMPK信号通路在肿瘤放射治疗方面的最新研究进展进行综述。

1 AMPK和肿瘤代谢

糖代谢的改变是肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要特征：大多数肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力比正常细胞强，但对葡萄糖的利用却比正常细胞差；即使在氧气充足的条件下，肿瘤细胞也主要以糖酵解代谢摄取能量，产生大量乳酸和 ATP，而不是采用产生 ATP 效率更高的线粒体氧化代谢方式，这就是著名的“Warburg 效应”，也即“有氧糖酵解”。糖酵解除了为肿瘤细胞提供更快的能量周转效率外，还为癌细胞提供大量糖酵解底物如核苷酸、氨基酸、脂肪酸，用于供给肿瘤细胞分裂和生长所必需的生物大分子合成[1]。最近研究发现，AMPK可以负调控Warburg现象[2]，抑制肿瘤细胞的生长，甚至可以重建葡萄糖的氧化磷酸化途径；而AMPK 缺失时，Warburg 现象的标志物乳酸盐的胞内含量明显增加，促进肿瘤细胞能量代谢。

2 AMPK的结构

AMPK是一种在进化中高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于真核生物体内。在哺乳动物，其主要以三种亚基(由α、β和 γ)组成异源三聚体的形式存在。α亚基为催化亚基，含有1个N端激酶结构域和1个C端结构域，N端是催化核心部位，有典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，C端含有自动抑制序列(AIS)，负责活性的调节以及联系β和γ亚单位。β亚基作为调节亚基，连接α和γ亚基，使AMPK组成一个有功能的异源三聚体。γ亚基也称为核苷酸结合亚基，其N端有四个重复序列，称为CBS基序，4个重复序列每两个构成一个基本功能单位Bateman 结构域，此区域是AMP和ADP的结合位点。

3 AMPK的调节

3.1 通过AMP/ATP比值调节

体内许多因素如缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饥饿、热休克等均可导致AMP/ATP比值显著增高，从而激活AMPK。

3.2 通过上游激酶激活

AMPK的上游激酶主要有：(1)LKB1，又称丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(serine/threonine protein kinase 11, STK11), 是由LKB1基因编码的一种抑癌基因。在代谢应激时，LKB1可以直接磷酸化AMPK-α亚基苏氨酸172位点激活AMPK，使AMPK活性呈百倍的增加；(2)钙调蛋白依赖性蛋白激酶β(CaMKKβ)，在下丘脑、神经元、T淋巴细胞中，它主要通过增加细胞内Ca2+水平从而激活AMPK[3]。

3.3 其他激活因子

5-氨基- 4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸( AICAR)是较早发现并广泛使用的一种AMPK激动剂，作为一种腺苷类似物，他可通过腺苷转运体被细胞摄取，并被腺苷激酶磷酸化形成AMP的类似物ZMP，从而激活AMPK[4]。Ⅱ型糖尿病治疗药物：二甲双胍[5]、苯乙双胍[6]通过不同的机制激活AMPK；此外，许多的天然植物药如水杨酸[7]、白藜芦醇[8]也可以激活AMPK，特别是水杨酸，其可以不依赖于AMPK上游激酶或AMP/ATP比值改变而直接激活AMPK。

4 AMPK在代谢应激反应和细胞生长中的作用

AMPK激活后，可以活化一系列下游底物，急剧地影响能量代谢与细胞生长，并可以调控与代谢进程改变相关的基因表达[9]。

4.1 AMPK与mTOR通道

蛋白质合成和细胞增殖是细胞代谢活动中的主要耗能环节。当细胞面临代谢压力、能量不足时，为了保存能量，AMPK被激活并通过抑制mTOR通路进而抑制蛋白质合成和细胞增殖[10]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞生长、增殖及周期调控密切相关。研究发现，AMPK通过多种途径抑制mTORC1活性。当细胞出现代谢应激和营养匮乏时，AMPK可以直接磷酸化TSC2上 Ser1345激活TSC2，形成TSC1/TSC2复合物，抑制mTOR活性[11]；Lee等人还发现AMPK可通过Akt依赖途径抑制mTOR，进而抑制结肠癌细胞蛋白质合成[12]；此外，AMPK还可以直接磷酸化mTORC1结合蛋白raptor，阻止mTOR对下游底物的活化[13]。

4.2 AMPK调节转录因子及周期

AMPK还参与调节多种转录因子，介导代谢应激与细胞存活的核内事件。例如，AMPK调节叉头框蛋白O3a(FOXO3a)[14]和固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)转录因子活性[15]；此外，AMPK还直接磷酸化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)共激活因子1(PGC-1α)，调节多种代谢基因及线粒体生物合成过程[16]。Bungard[17]等人还发现，AMPK通过直接活化组蛋白H2B，激活基因的转录调节，以应对能量匮乏。AMPK直接磷酸化p53蛋白的Ser15位点并通过 SIRT1抑制p53的去乙酰化作用[18]，两种方式共同维持p53稳定表达。活化的p53通过介导p53-p21cip1轴调控细胞周期进程，保证细胞在营养不足或生长因子匮乏时的存活。

总之，AMPK可靶向作用于多种信号途径，或急性激活多种效应底物或调控基因的转录水平以应对细胞应激压力并调节细胞的存活。正因如此，寻找AMPK的有效激活途径并与肿瘤经典治疗方法结合起来，为提高肿瘤的治疗有效率成为国内外学者研究的热点。而近年研究发现，放射可激活AMPK，同时，联合使用药物激活AMPK增加放射治疗对肿瘤细胞的杀伤效应。

5 AMPK与辐射应答

5.1 ATM-AMPK与DNA损伤修复(DDR)

DNA损伤修复途径感知多种DNA物理结构上的改变，包括单链断裂或潜在的致死性双链断裂(DSB)。在真核生物，DNA断裂损伤后主要有6种修复途径，而双链断裂(DSB)主要依靠非同源末端修复。ATM作为DNA损伤的关键感受器，在DSB介导DDR途径中具有重要作用。研究表明，AMPK是ATM信号途径中的一个关键效应器。使用化学药物 KU- 55933抑制ATM后，电离辐射介导的ATM活性被明显减弱，并随之抑制AMPK磷酸化[19]。Storozhuk[5]等人使用更特异性的ATM抑制剂 KU60019(其作用等同于ATM分子敲除)同样验证了这一结果。然而电离辐射介导的ATM调节AMPK的确切机制还不清楚，ATM好像并未直接调节AMPKα 磷酸化[20]。早期的研究发现电离辐射激活ATM，进而磷酸化LKB1，这可能为ATM介导AMPK的活化提供了一条途径。然而，多项研究表明[19-21]，电离辐射介导的AMPK活化并不需要LKB1参与。如在LKB1缺乏的A549和H23肺癌细胞，照射后AMPK活性稳定表达。

5.2 IR(电离辐射)调节AMPK

电离辐射通过ATM激活AMPK，磷酸化AMPKα 数分钟后即可在细胞核内观察到，但是一个小时后磷酸化AMPKα 逐渐转移到胞质[19]，这种亚细胞迁移的意义目前尚不清楚。有学者推测，这一事件可能有利于AMPK在胞质内发挥对蛋白质的合成、细胞代谢以及调控线粒体功能的作用。

电离辐射除对AMPK急性调节外，也调节AMPK的长期表达和活性[21-22]。单次8Gy射线照射肺癌细胞48小时后，仍检测到AMPK 亚基mRNA和蛋白表达升高。Storozhuk[21]在A549和H1299肺癌细胞及前列腺癌肿瘤模型给予单次10Gy射线照射，照射8周后AMPK亚基仍持续表达，表明电离辐射对基因表达的长期调控，也说明了AMPK信号对辐射的长期应答。但电离辐射对AMPK慢性调节机制并不完全清楚，学者们猜测p53可能起到重要作用。一方面，电离辐射介导AMPK磷酸化并激活p53 Ser15位点有利于p53的稳定表达[23]。另一方面，p53通过两种机制调节AMPK水平：(1)p53增加SESN2表达，促进SESN2与AMPK结合并激活其活性[24]；(2)通过依赖于p53，对 AMPKβ1/2基因进行转录上调[25]。

5.3 AMPK与IR介导的细胞周期调控

电离辐射后细胞周期调控途径迅速被激活，以促进DNA修复，并调节细胞的存活。Bungard[17]的研究显示，野生型MEFs在X线照射或者UV照射后促进了p53和p21cip1基因转录；而AMPKα1/2-/-MEFs经UV照射后，p53和p21cip1较野生型MEFs呈显著性下降。使用compound C抑制或siRNA沉默肺癌细胞AMPK基因表达后，辐射介导的肺癌细胞p53和p21cip1表达也降低[5,19]。这无疑证明AMPK是电离辐射介导周期调控的一个重要因子。电离辐射激活ATM，并进一步激活AMPK-p53及p53-p21cip1轴。同时，Sanli[19]也发现无论是AMPKα1/2-/-MEFs或使用siRNAs敲除AMPKα1/2的A549细胞，产生射线抵抗，推测可能的机制是通过增强Akt-mTOR 信号以及缺乏辐射介导的p53/p21cip1周期阻滞及促调亡途径，增加了此类细胞照射后的存活。此外，研究还发现，辐射介导的p21cip1表达并不一定依赖p53参与，在p53缺乏的细胞中已得到验证，而且发现其依赖于ATM-AMPK-p21waf/cip途径[19]。

5.4 AMPK激活剂增强放射敏感性

肿瘤细胞照射后，迅速激活促生存通路，导致基因的转录和翻译。这一过程受到 ATM和AMPK调控[26]。大量研究发现，抑制AMPK后细胞对射线的敏感性下降。 在AMPKα1/2-/-MEFs以及通过siRNA沉默AMPK的肺癌细胞，照射后细胞存活率明显增加。这与电离辐射介导AMPK活化，抑制mTOR信号有关，AMPK活性缺乏将直接导致mTOR信号的增强，细胞的存活上升[5，22，27]。

相反，实践证明使用 AMPK激活剂联合放射治疗，增加了癌细胞放射毒性效应，这一途径对改善肿瘤细胞原发或继发性放射线抵抗具有重要的应用前景。过去几年，大量的AMPK激活剂被联合应用于放射实验。洛伐他丁(HMG-CoA还原酶抑制剂)可以激活AMPK，联合照射时增加了辐射介导的细胞凋亡，提高了肺癌细胞对射线的敏感性[28]。最近，Rashid 等人[8]在前列腺癌细胞使用多酚类植物抗毒素-白藜芦醇，发现低剂量(2.5～10uM)白藜芦醇即可抑制Akt-mTOR信号，增强 AMPK-p53-p21cip1轴的活性，明显改善放射抵抗型前列腺癌对射线的敏感性。

二甲双胍作为2型糖尿病治疗药物，近年来，在辅助肿瘤治疗方面也显现出非常广阔的应用前景。早期研究[19]发现使用临床安全剂量的二甲双胍即可增加肺癌细胞对射线的敏感性；而Storozhuk[5]在肺癌组织培养及动物模型中均验证了这一结果。Song[29]等在乳腺癌细胞和肉瘤细胞的体内及体外实验均表明二甲双胍通过激活AMPK抑制mTOR活性，特别是对肿瘤干细胞的细胞毒性，有效地增强了辐射介导的细胞死亡。相反，使用compound C抑制或特异性siRNA沉默AMPK后，大幅度地减弱二甲双胍单独使用或与电离辐射联合时降低的克隆形成率，更加佐证了AMPK在调节细胞放射敏感性方面的重要性。

6 AMPK与自噬

AMPK主要发挥肿瘤抑制作用，其活性水平增高可以增强放射治疗的细胞毒性效应。然而，AMPK信号同样刺激细胞自噬性存活。能量不足时(饥饿和应激)AMPK通过直接磷酸化UNC51样激酶1(ULK1)或抑制mTOR，促进自噬产生。一些学者认为，自噬通过消化清除受损的细胞器，进行营养和能量重新分配，保护癌细胞在代谢需求增加的情况下生存，产生放射线抵抗，促进细胞存活[30]。Chen[31]等人通过对鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性研究，发现腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)通过AMPK/mTOR通路促进鼻咽癌细胞照射后自噬，产生放射线抵抗。而抑制PARP-1或AMPK放射抵抗得到明显改善。此外，细胞自噬也表现出对依托泊苷的化疗抵抗，而这一效应在抑制AMPK后可以得到逆转[32]。

总的来说，活化的AMPK通过一系列下游效应分子介导照射后的辐射应答：(1)调节电离辐射后p53和 p21cip1轴，参与电离辐射介导的G1、G2/M期细胞周期阻滞、细胞凋亡的调控。(2)抑制促增殖信号Akt-mTOR通路，并参与自噬调节，共同调节细胞的放射敏感性及细胞存活。

7 总结与展望

AMPK是维持细胞能量自我平衡的一个关键调节器。肿瘤细胞特有的“有氧糖酵解”现象将AMPK与肿瘤代谢调节、细胞存活和增殖的调控紧密联系起来。研究结果表明：AMPK抑制促增殖信号、调节细胞周期进程、参与自噬调控并与放射治疗具有密切联系。但是AMPK活化后对细胞代谢和细胞存活的调节是复杂的，不同的激活因子、不同的细胞类型可能诱导不同的下游通路，产生复杂的生物学效应，甚至完全相反的结果。根据不同的细胞类型，选择合适的AMPK激活剂可以提高放射治疗的敏感性，从而为提高肿瘤的治愈率提供新的选择。

[1] Shaw RJ. Glucose metabolism and cancer[J]. Curr Opin Cell Biol, 2006, 18(6): 598-608.

[2] Faubert B, Boily G, Izreig S, et al. AMPK is a negative regulator of the Warburg effect and suppresses tumor growth in vivo[J]. Cell Metab, 2013, 17(1): 113-124.

[3] Woods A, Dickerson K, Heath R, et al. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-β acts upstream of AMP-activated protein kinase in mammalian cells[J]. Cell Metab, 2005, 2(1): 21-33.

[4] Gaidhu MP, Frontini A, Hung S, et al. Chronic AMP-kinase activation with AICAR reduces adiposity by remodeling adipocyte metabolism and increasing leptin sensitivity[J]. J Lipid Res, 2011, 52(9): 1702-1711.

[5] Storozhuk Y, Hopmans SN, Sanli T, et al. Metformin inhibits growth and enhances radiation response of non-small cell lung cancer (NSCLC) through ATM and AMPK[J]. Br J Cancer, 2013, 108(10): 2021-2032.

[6] Wang J, Xia SA, Zhu Z. Synergistic effect of phenformin in non-small cell lung cancer (NSCLC) ionizing radiation treatment[J]. Cell Biochem Biophys, 2015, 71(2): 513-518.

[7] Hawley SA, Fullerton MD, Ross FA, et al. The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase[J]. Science, 2012, 336(6083): 918-922.

[8] Rashid A, Liu C, Sanli T, et al. Resveratrol enhances prostate cancer cell response to ionizing radiation. Modulation of the AMPK, Akt and mTOR pathways[J]. Radiat Oncol, 2011, 6(1): 144.

[9] Mihaylova MM, Shaw RJ. The AMPK signalling pathway coordinates cell growth, autophagy and metabolism[J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(9): 1016-1023.

[10]Shaw RJ. LKB1 and AMP-activated protein kinase control of mTOR signalling and growth[J]. Acta Physiol (Oxf), 2009, 196(1): 65-80.

[11]van Veelen W, Korsse SE, van de Laar L, et al. The long and winding road to rational treatment of cancer associated with LKB1/AMPK/TSC/mTORC1 signaling[J]. Oncogene, 2011, 30(20): 2289-2303.

[12]Lee YK, Park SY, Kim YM, et al. Suppression of mTOR via Akt dependent and independent mechanisms in selenium treated colon cancer cells: involvement of AMPK alpha1[J]. Carcinogenesis, 2010, 31(6): 1092-1099.

[13]Gwinn DM, Shackelford DB, Egan DF, et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint[J]. Mol Cell, 2008, 30(2): 214-226.

[14]Greer EL, Oskoui PR, Banko MR, et al. The energy sensor AMP-activated protein kinase directly regulates the mammalian FOXO3 transcription factor[J]. J Biol Chem, 2007, 282(41): 30107-30119.

[15]Li Y, Xu S, Mihaylova MM, et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice[J]. Cell Metab, 2011, 13(4): 376-388.

[16]Jager S, Handschin C, Pierre JS, et al. AMP-activated protein kinase (AMPK) action in skeletal muscle via direct phosphorylation of PGC-1α[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(29): 12017-12022.

[17]Bungard D, Fuerth BJ, Zeng PY, et al. Signaling kinase AMPK activates stress-promoted transcription via histone H2B phosphorylation[J]. Science, 2010, 329(5996): 1201-1205.

[18]Lee CW, Wong LL, Tse EY, et al. AMPK promotes p53 acetylation via phosphorylation and inactivation of SIRT1 in liver cancer cells[J]. Cancer Res, 2012, 72(17): 4394-4404.

[19]Sanli T, Rashid A, Liu C, et al. Ionizing radiation activates AMP-activated kinase (AMPK): a target for radiosensitization of human cancer cells[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2010, 78(1): 221-229.

[20]Woods A, Leiper JM, Carling D. The role of ATM in response to metformin treatment and activation of AMPK[J]. Nat Genet, 2012, 44(4): 359-360.

[21]Storozhuk Y, Sanli T, Hopmans SN, et al. Chronic modulation of AMP-Kinase, Akt and mTOR pathways by ionizing radiation in human lung cancer xenografts[J]. Radiat Oncol, 2012, 7: 71.

[22]Sanli T, Storozhuk Y, Linher-Melville K, et al. Ionizing radiation regulates the expression of AMP-activated protein kinase (AMPK) in epithelial cancer cells: modulation of cellular signals regulating cell cycle and survival[J]. Radiat Oncol, 2012, 102(3): 459-465.

[23]Maclaine NJ, Hupp TR. The regulation of p53 by phosphorylation: a model for how distinct signals integrate into the p53 pathway[J]. Aging, 2009, 1(5):490-502.

[24]Budanov AV, Karin M. p53 target genes sestrin1 and sestrin2 connect genotoxic stress and mTOR signaling[J]. Cell, 2008, 134(3): 451-460.

[25]Feng Z, Hu W, De Stanchina E, et al. The regulation of AMPK beta1, TSC2, and PTEN expression by p53: stress, cell and tissue specificity, and the role of these gene products in modulating the IGF-1-AKT-mTOR pathways[J]. Cancer Res, 2007, 67(7): 3043-3053.

[26]Braunstein S, Badura ML, Xi Q, et al. Regulation of protein synthesis by ionizing radiation[J]. Mol Cell Biol, 2009, 29(21): 5645-5656.

[27]Zannella VE, Cojocari D, Hilgendorf S, et al. AMPK regulates metabolism and survival in response to ionizing radiation[J]. Radiat Oncol, 2011, 99(3): 293-299.

[28]Sanli T, Liu C, Rashid A, et al. Lovastatin sensitizes lung cancer cells to ionizing radiation: modulation of molecular pathways of radioresistance and tumor suppression[J]. J Thorac Oncol, 2011, 6(3): 439-450.

[29]Song CW, Lee H, Dings RPM, et al. Metformin kills and radiosensitizes cancer cells and preferentially kills cancer stem cells[J]. Sci Rep, 2012, 2:362.

[30]Apel A, Herr I, Schwarz H, et al. Blocked autophagy sensitizes resistant carcinoma cells to radiation therapy[J]. Cancer Res, 2008, 68(5): 1485-1494.

[31]Chen ZT, Zhao W, Qu S, et al. PARP- 1 promotes autophagy via the AMPK/mTOR pathway in CNE- 2 human nasopharyngeal carcinoma cells following ionizing radiation, while inhibition of autophagy contributes to the radiation sensitization of CNE- 2 cells[J]. Mol Med Rep,2015, 12(2): 1868-1876.

[32]Xie BS, Zhao HC, Yao SK, et al. Autophagy inhibition enhances etoposide-induced cell death in human hepatoma G2 cells[J]. Int J Mol Med，2011, 27(4): 599-606.

2015- 11- 11

2016- 01- 24

易光明(1989-)，男，四川绵阳人，在读硕士，主要研究方向：肿瘤非手术治疗。

△郎锦义，教授，主任医师，博士生导师，E-mail:langjy610@163.com

R730.55

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.01.009