甘草次酸和EGF对HaCaT细胞miR-21/ PDCD4表达的调控研究

曾武城　曹　毅★　杨晓红　陶茂灿　罗宏宾

甘草次酸和EGF对HaCaT细胞miR-21/ PDCD4表达的调控研究

曾武城曹毅★杨晓红陶茂灿罗宏宾

目的 探讨甘草次酸和表皮生长因子（EGF）对角质细胞（HaCaT）miR-21/PDCD4表达的调控作用。方法 PCR法检测空白组、25ng/mlEGF组、25μm甘草次酸组、25ng/mlEGF联合25μm甘草次酸组对HaCaT细胞miR-21、PDCD4mRNA表达的影响。结果 25μm甘草次酸明显抑制HaCaT细胞miR-21的表达水平，促进HaCaT细胞PDCD4mRNA的表达；25μm甘草次酸抑制25ng/mlEGF对HaCaT细胞miR-21的促表达作用，25μm甘草次酸抑制25ng/mlEGF对HaCaT细胞PDCD4mRNA的下调作用。结论 甘草次酸抑制HaCaT细胞miR-21的表达、上调PDCD4mRNA的表达，同时可抑制EGF对HaCaT细胞miR-21的促表达作用和对PDCD4mRNA的下调作用。

甘草次酸 表皮生长因子 miR-21/PDCD4 银屑病

近年来基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子miRNA，逐渐被发现在银屑病的发病机制中发挥重要作用［1］。目前基本可以明确在银屑病的皮损及外周血中miR-21表达升高，但对其功能的研究还处在初级阶段。前期实验研究发现甘草次酸可以浓度依赖性地抑制角质细胞（HaCaT）增殖，并下调表皮生长因子（EGF）对HaCaT细胞的促增殖作用［2］。在此项研究中，作者将对甘草次酸和EGF作用下HaCaT细胞miR-21及其靶蛋白PDCD4表达的改变进行观察，进一步阐明甘草次酸抑制HaCaT细胞增殖的可能机制，为甘草次酸在银屑病中的应用奠定部分实验基础。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器 高糖细胞培养基（DMEM）、胎牛血清、0.25% 胰酶/EDTA（美国Invitrogen公司），甘草次酸（上海同田生物公司），EGF（上海同田生物公司 ），逆转录试剂盒、扩增试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］，核糖核酸提取试剂盒Trizol（lnvitrogen公司），ABI-7900HT高通道荧光定量PCR仪（美国）。1.2 细胞培养 角质形成细胞株HaCaT细胞为冻存细胞，使用高糖DMEM培养基［内含10%（V/V）胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素］，培养条件为5%CO2、37℃恒温培养箱，饱和湿度95%。

1.3Real time PCR法检测EGF、甘草次酸对HaCaT细胞miR-21/PDCD4表达情况的影响 （1）细胞处理：取对数生长期HaCaT细胞用胰酶/EDTA消化后重悬于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中24h后，细胞长满板底70%～80%，移出培养基，用PBS冲洗2次后进行分组处理，空白组：加入3ml无血清DMEM。EGF组：加入含EGF （25 ng/ ml） 的无血清DMEM 3ml。甘草次酸组：加入含甘草次酸 （25μm） 的无血清DMEM 3ml。甘草次酸联合EGF组：加含EGF （25ng/ml）及甘草次酸 （25μm）的无血清DMEM 3ml。继续孵育24h后，提取细胞总RNA。（2）总RNA的提取：方法参照宝生物工程（大连）有限公司RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）说明书，所有操作均用无酶无菌的相关耗材，注意严格无酶操作，提取处理24h后各组细胞总RNA，提完后溶于DEPC水中至50μl，测各组RNA浓度后分装，-70℃保存待用。（3）miR-21、PDCD4 cDNA的制备：miR-21cDNA严格按照说明书，反转录反应体系包括：2×miRNA Reaction Buffer Mix （for Real Time）* 1 10μl； miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2μl；0.1% BSA 2μl；总RNA及无RNA酶水共6μl，总反应体系20μl，逆转录条件：37℃ 60min，85℃ 5s。PDCD4 cDNA用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒，反转录反应体系包括：10×RT Buffer 2μl；25×dNTP Mix（100mM） 0.8μl；10×RT Random Primers 2.0μl；MultiScribe Reuerse Transcriptase 1.0μl；总RNA及无RNA酶水共14.2μl，总反应体系为20μl，逆转录条件：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃5min；进行miR-21、PDCD4反转录体系配置时应额外增加10%的点样量以补偿后续过程中可能的消耗；反转录时，所有操作均用无酶无菌的相关耗材，注意严格无酶操作，所有操作在冰上完成；逆转录完成后立即放冰上冷却，然后继续进行相应PCR扩增操作或-20度保存。（4）Real-time PCR扩增引物设计与合成：miR-21、5s特异性扩增引物由生物工程（大连）有限公司设计合成。PDCD4、Actin引物自行设计并由上海生物有限公司合成，PDCD4 上游引物：5'-GGGAAGGTTGCTGGATAGG，下游引物：5'-GTTCTCCTGGTCATCATCATAGTT，Actin上游引物：5'-TAAGTAGGCGCACAGTAGGTCTGA，下游引物：5'-AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG。Real-time PCR在ABI 7900 HT高通道荧光定量PCR仪上进行，每个样本重复3次。反应条件：①预变性 95℃ 10s。②PCR反应，95℃ 5s，60℃ 20s，重复40次。③熔解。1.4 荧光定量RT-PCR结果分析 结合扩增曲线及熔解曲线分析，排除不合适的扩增样本，将符合要求的miR-21、PDCD4荧光定量RT-PCR原始数据（采用系统自动分析获取Ct值）取3次重复的平均值，用SPSS统计软件进行数据处理。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1甘草次酸能抑制HaCaT细胞miR-21的表达，并可抑制EGF对HaCaT细胞miR-21的促表达作用 使用Real time PCR法检测25 ng/mlEGF组、25 μm甘草次酸组、25 ng/ml EGF联合 25 μm甘草次酸组对HaCaT细胞miR-21表达影响，25 ng/mlEGF组、25 μm甘草次酸组及25 ng/mlEGF联合25 μm甘草次酸组miR-21表达分别为空白对照组的（2.28±0.11）、（0.24±0.05）、（0.68±0.08）倍（P＜0.01），且组间相比差异有统计学意义（P＜0.05），与空白对照组比较，发现25 μm甘草次酸组能明显抑制HaCaT细胞miR-21的表达，25 ng/mlEGF组能明显促进HaCaT细胞miR-21的表达，同时25 μm甘草次酸能抑制25 ng/ mlEGF对HaCaT细胞miR-21的促表达作用（P＜0.01）。2.2 甘草次酸能促进HaCaT细胞PDCD4 mRNA的表达，同时能抑制EGF对HaCaT细胞PDCD4mRNA的抑制作用 使用Real time PCR法检测25 ng/mlEGF组、25μm甘草次酸组、25 ng/ml EGF联合 25 μm甘草次酸组对HaCaT细胞PDCD4mRNA的表达影响，25 ng/ mlEGF组、25 μm甘草次酸组及25 ng/mlEGF联合25 μm甘草次酸组PDCD4mRNA表达分别为空白对照组的（0.32±0.09）、（2.76±0.12）、（0.56±0.07）倍（P＜0.01），且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），与空白对照组比较，25 μm甘草次酸组能明显促进HaCaT细胞PDCD4 mRNA的表达，25 ng/mlEGF组能明显抑制HaCaT细胞PDCD4mRNA的表达，同时25μm甘草次酸能抑制25ng/mlEGF对HaCaT细胞PDCD4mRNA的抑制作用（P＜0.01）。

3　讨论

miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，约20～24 核苷酸长度，可特异性的识别靶mRNA 的3’非翻译区（3’UTR）并与之结合，引起靶mRNA的降解或翻译抑制，从而对靶基因进行转录后表达调控，进而调节较多重要的细胞活动［3］。miR-21是唯一在所有已检测的恶性肿瘤中均表达上调的miRNA，包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤中［4］。有研究表明，PTEN、PDCD4、Maspin、TPMI以及TIMP-3等均可能受到miR-21的靶向调节，参与细胞生长、侵袭和转移等表型的特征性调控［5］。目前基本可以明确在银屑病的皮损及外周血中miR-21表达升高，但对其功能的研究还处在初级阶段。Ahmed等［6］发现BMP4可以通过抑制角质形成细胞中miR-21的表达促进PTEN、PDCD4、等靶蛋白的表达，发挥对HaCaT细胞增殖和迁移的抑制作用，提示在皮肤角质形成细胞中miR-21是BMP信号系统的重要下游因子，miR-21在维持角质形成细胞的增殖和迁移过程中发挥重要作用。

甘草次酸作为甘草甜素的主要活性代谢产物，具有抗炎、镇痛、抗过敏、抗人类免疫缺陷病毒、抗肿瘤、抗突变、提高机体免疫力等作用，受到了国内外医药学界的重视。近年来以甘草甜素作为主要成分的美能制剂作为银屑病的辅助治疗药物已经得到广泛应用。甘草甜素本身也具有生物活性，但均较甘草次酸弱，是甘草次酸的前体药物，甘草甜素被认为具有糖皮质激素样的生物学作用，而无糖皮质激素的副作用。作者认为甘草次酸作为甘草甜素的主要活性代谢产物，将来可能可以作为有效而且安全的制剂应用于银屑病治疗，因此必须要有相关的实验支持。前期实验证明，甘草次酸在1～100μm/L范围内浓度依赖性抑制HaCaT细胞增殖，同时通过抑制HaCaT细胞增殖下调EGF对HaCaT细胞的促增殖作用［2］，在此项研究中，作者以甘草次酸对HaCaT细胞miR-21/ PDCD4信号通路的调控为着点，对甘草次酸抗银屑病角质形成细胞增殖机制进行深入研究。本实验结果显示与空白对照组比较，25μm甘草次酸可有效抑制HaCaT细胞miR-21的表达水平，同时上调PDCD4mRNA的表达；还可下调25ng/ml EGF对HaCaT细胞miR-21的促表达作用和对PDCD4mRNA的抑制作用，结果提示甘草次酸与EGF可以对miR-21/PDCD4信号通路发挥一定的调控作用，miR-21/PDCD4在甘草次酸抑制EGF对HaCaT细胞的促增殖作用中可能发挥重要作用，结果为甘草次酸在银屑病治疗中的开发应用提供实验基础。

1 Bostjancic E， Glavac D. Importance of micro RNAs in skin morphogenesis and diseases. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat，2008， 17（3）：95～102.

2 解凡，曹毅，刘改荣，等.甘草次酸抑制表皮细胞生长因子对HaCaT细胞促增殖作用的机制研究.中华皮肤科杂志，2013，46（4）：278～281.

3 Kluiver J，Gibcus JH， Hettinga C， et al.Rapid Generation of MicroRNA Sponges for MicroRNA Inhibition.PLoS One，2012，7（1）：e29275.

4 Pan X， Wang ZX， Wang R. MicroRNA-21： a novel therapeutic target in human cancer. Cancer Biol Ther，2011，10（12）：1224～1232.

5 Sheedy FJ，Palsson-McDermott E， Hennessy EJ，et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21.Nature Immunology，2010，11（2）：141～147.

6 Ahmed MI，Mardaryev AN，Lewis CJ，et al.MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci，2011，124（Pt 20）：3399～3404.

Objective To explore the effects of glycyrrhetinic acid and EGF on the expression of miR-21/PDCD4 in HaCaT cells. Methods PCR was used to detect in the blank group、25ng/ml EGF group、25μM glycyrrhetinic acid group、25 ng/ml EGF and 25μM glycyrrhetinic acid group on the effects of the expression of miR-21、PDCD4 mRNA in HaCaT cells. Results 25μM glycyrrhetinic acid significantly inhibited the expression level of miR-21 on HaCaT cell and promoted the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cell； 25μM glycyrrhetinic acid significantly inhibited the effect of 25ng/ml EGF on stimulating expression of miR-21 in HaCaT cell，and inhibiting the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cells. Conclusions Glycyrrhetinic acid inhibits the expression of miR-21 and stimulates the expression of PDCD4mRNA in HaCaT cells，and glycyrrhetinic acid inhibits the effect of EGF on stimulating the expression of miR-21 and down-regulates the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cells.

Glycyrrhetinic acid EGF miR-21/PDCD4 Psoriasis

310007 杭州市中医院（曾武城）

310006 浙江中医药大学附属第一医院（曹毅 杨晓红陶茂灿 罗宏宾）