浅析禾草内生真菌育种研究进展

杨鼎元，钟 理，吴佳海，，罗 充，张文超

（1．贵州师范大学生命科学学院， 贵阳550003； 2．贵州草业研究所， 贵阳550006）

禾草内生真菌（Grass Endophyte），是指在禾本科草类植物体内完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症的微生物［1］。禾草内生真菌普遍存在于在禾本科各类植株之中，它们一方面寄居在禾草的细胞间隙营寄生生活；另一方面又可通过促进禾草的生长、增强禾草抗逆性来与寄生的禾草达成互惠共生关系［2］。目前关于禾草内生真菌的相关研究主要集中在子囊菌门核菌纲肉座菌目麦角菌科香柱菌属（Epichloё）及其无性型（Neotyphodium）之中［3－4］，其中无性型（Neotyphodium）禾草内生真菌因其对禾草植物广泛的侵染和特殊的作用，具有较高的科研价值［5－7］。

1 禾草内生真菌的作用

1．1 提高宿主对生物胁迫的抗性

内生真菌可以提高宿主对生物胁迫如家畜、害虫取食及微生物源所致病害等的抗性。被内生真菌侵染形成的禾草－内生真菌共生体（EI）同未被内生真菌侵染的禾草（EF）相比，可以通过内生真菌分泌的震颤素（Lolitrem B）、波 胺 （Peramine）、麦 角 碱 （Ergot alkaloids）和饱和吡咯类（Pyrrolizidine）化合物表现出抗虫性和抗采食特性［8］。早在上世纪40年代，新西兰就针对家畜误食带内生真菌的黑麦草引发的中毒事件进行了报道［2］，80年代，国外研究发现EI型的多花黑麦草（Lolium perenne）对于阿根廷象甲（Listronotus bonariensis）采食的抑制［9］，目前，有大量研究证明，禾草－内生真菌共生体对包括线虫纲、昆虫纲、蛛形纲等无脊椎动物取食具有抗性［9－20］。此外，禾草内生真菌往往还会通过生态位竞争、诱导抗病性和抑菌活性物质的分泌对病源微生物造成影响，进而使宿主获得相应的抗病性［21－22］，已有报道的禾草内生真菌所拮抗的病源菌主要有：链格孢属、壳二孢属、离蠕孢属、镰刀菌属和德氏霉属等［23］。

1．2 提高宿主对非生物胁迫的抗性

内生真菌可以提高宿主抗旱、抗寒、耐盐碱等非生物胁迫的能力。Karsten发现，内生真菌的侵染可以提高宿主可溶性糖的含量，参与调节宿主植株体内的渗透压［24］；任安芝的实验结果表明，内生真菌的侵染可降低细胞膜通透性、脯氨酸的积累［25］。这些学者从生理生化的角度证实了内生真菌的侵染可提高对干旱胁迫的抗性。另一些研究表明，内生真菌的侵染能提高低温条件下宿主种子的萌发情况此外，内生真菌的侵染能提高低温条件下宿主的种子萌发率、植株株高、分蘖数和叶片数，还能促进地下生物量的积累，增强抗寒性，提高宿主的越冬能力［26－29］。王志伟［30］在一些高盐碱地区采集的禾草植物中发现普遍存在内生真菌，彭清青通过对不同酸碱条件下几种禾草萌发情况的对比，发现内生真菌的侵染可以显著提高EI型禾草的发芽率，对胚芽和胚根生长也有显著的促进作用［31］。

1．3 促进宿主生长

内生真菌对宿主的生长具有促进作用［32］：一方面内生真菌可以分泌促进植物生长的活性物质如植物生长素、赤霉素以及细胞分裂激素等［33］，例如袁志林［34］筛选出一株广谱内生真菌，具有良好的促生作用，进一步研究后发现该菌株可以分泌吲哚乙酸（IAA）；另一方面内生真菌可促进宿主对营养物质（氮［35］、磷和矿质元素［36］）的吸收，提高宿主的资源利用率，增加宿主叶面积、分蘖数、生长速度进而促进宿主植株的生长［37］。

图1 禾草内生真菌对宿主植株的作用

2 禾草内生真菌的育种概况

目前，全世界的温带禾草中约有10%的种类带有内生真菌，早熟禾亚科有30%带有香柱菌属的内生真菌［37－38］，利用内生真菌进行禾草育种特别是抗性育种是近年来国外草业育种的一个趋势［39］，国内尚未见育成品种的报道，但相关进展良好［40］。这种育种方法借助内生真菌对禾草各方面的增益和内生真菌随宿主种子垂直传播的种传特性［41］进行。利用内生真菌进行的育种具有以下优势：首先，内生真菌不产生子实体，缺乏有性繁殖，决定了内生真菌的寄生特性不会造成种间、个体间的泛滥传播［42－43］，对环境具备安全性；其次，通过内生真菌介导的目的性状可较稳定的得到表达［44］，且目的性状还可具有通过侵染植株形成的种子保留的可能性，对育种具备高效性。有国外学者以“下一代的分子育种”对内生真菌育种进行称赞［45］。

2．1 牧草育种

EI宿主的植株会产生针对取食者的毒性，因此利用内生真菌进行牧草育种时，首先需要保证含内生真菌的牧草对牲畜和人的安全性，其次才是目标性状的表达。

为达成这一育种目标，利用内生真菌培育牧草时，一方面可以从被内生真菌侵染的禾草中筛选不产生毒害作用的内生真菌菌株，再通过育种手段进行饲用品质培育。Latch［46］通过对黑麦草中存在的内生真菌分离研究，筛选出了兼顾抗虫和无毒特性的内生真菌（Neotyphodium lolii）种类，并通过技术手段回接到了黑麦草中，获得了具有抗蚜虫特性的黑麦草牧草品种“AR 1”。Bluett［47］经过多年的放牧试验，证明了黑麦草牧草品种“AR 1”具有较优秀的农艺性状，然后通过对只取食“AR 1”黑麦草的奶牛体内相关指标的检测，证实该品种对家畜的安全性，目前该牧草已经通过了欧盟的检测进入欧洲市场。此外，美国也培育出对家畜无毒害的EI型高羊茅牧草“AR 542”，该品种的高羊茅虽然未表现出抗虫特性，但与EF型高羊茅相比较展现出卓越的农艺性状［48－49］，目前也已在美国推广种植。另一方面可以先从被内生真菌侵染的禾草中分析筛选可以提高宿主饲用品质，但对牲畜可能具有潜在毒害作用的菌株，然后通过基因敲除、基因沉默等技术抑制内生真菌的毒素合成基因表达［8］，现在已经探明无性型禾草内生真菌Neotyphodium coenophialum产生毒素麦角酸的是dmaW基因［19］。鉴于内生真菌的这种遗传特性，保证了这种育种方法的稳定性、可靠性和安全性［50］，与传统的分子育种相比，更容易被公众所接受。

同时国外有报道［51］称可通过给家畜注射抗寄生虫药物（伊维菌素），从而达到家畜误食EI型有毒牧草的解毒功效，这提示了利用内生真菌选育牧草时，可以通过研发配套的抗毒素物质疫苗，通过药理方法来消除或减轻家畜取食EI型牧草可能带来的毒害作用，极大的拓展了育种思路，展现了利用内生真菌进行牧草育种的潜力。

2．2 草坪草育种

和牧草育种相比，利用内生真菌进行草坪草育种较为便捷，不需要考虑因禾草内生真菌分泌产生的代谢产物如波胺（Peramine），麦角缬氨酸（Ergot）等可能造成的家畜食用中毒事件，草坪草育种多通过禾草内生真菌对宿主的促生作用和抗性的增强，从而达到提升草坪草的农艺性状和抗逆性的育种目标。高带菌率的草坪草除了具有各种抵御生物／非生物胁迫的能力，往往对其他植物具有还有很强的他感作用［52］，这些优势可减少除草剂、杀虫剂、化肥等的使用，节省了大量的管理、经济成本，更降低了环境的危害。

美国早在上世纪90年代就将EI型草坪草投入商业运营，这些商用品种包括了‘Advent’、‘Assure’、‘Dandy’、‘DasherⅡ’、‘Gettysburg’、‘Pinnacle’等［53－54］优质草坪草草种；此外在美国的部分机场已经开始使用通过内生真菌所分泌的次生代谢产物从而获得抗鸟采食特性的新型草坪草种‘Avanex’，极大的降低了飞机在起飞、降落等过程中因为撞击或引擎吸入飞鸟而导致的安全隐患及经济损失［55］。在国外商用的草坪草种子中，内生真菌的侵染率是同种子发芽率、纯净度相提并论并出现在种子标签上的重要指标［8，56］，据统计，每年约有6 000t的 EI型草坪草种子被应用于欧美的足球场、城市绿化等项目中［54］。

3 存在问题

国外诸多实例表明，通过禾草内生真菌来进行优良禾草的选育是可行的，但仍然存在诸如多问题尚未研究透彻，需要进一步深入研究。

3．1 内生真菌筛选较难

内生真菌生物学特性研究是利用其进行禾草育种研究的前期基础研究，本质上是通过体外培养（内生真菌侵染组织块表面消毒、接种到营养培养基、然后再分离纯化）获取内生真菌菌株。但这种研究方法存在几个问题：虽然禾草内生真菌是一个多样性丰富的群体［2］，但许多种类的内生真菌生长缓慢，在分离过程中易被植株内部的其他非目标菌污染［57］，更有不能通过体外培养进行分离鉴定的种类，分离得到非目标菌机率较大。此外，在育种研究中可利用的内生真菌活性物质种类很多，但内生真菌的分泌量却很少，且这些活性物质往往会随着环境、生境的改变而不同［58］，这给禾草内生真菌的鉴定、培养和开发利用带来了很多难题。

3．2 回接技术尚需改进

国内对内生真菌回接到宿主的方法通常是采用较为便捷且容易操作的无菌幼苗感染［59］、无菌种子感染［60］和分蘖部位感染［61］等方法；国外多采用更为精细但要求较高的分生组织［46］、愈伤组织体或体细胞细胞胚［62］导入法。但这些方法不同程度上存在稳定性差、成功率低等缺点。目前内生固氮细菌的回接技术研究较多，鉴于内生真菌和内生细菌的相似性，或可借助这些技术进行回接方法上的改进［63］。

3．3 禾草－内生真菌共生体性状表达复杂

大量研究表明，禾草内生真菌的侵染能够提高宿主的抗性，但另有一些研究表明，在相同条件下，一种禾草内生真菌可以提高某个宿主品种某方面的抗性，却对这种宿主另一个品种没有作用［64］；Gundel的研究表明，内生真菌的侵染与种子萌发没有关系［65］，而在国内外类似的研究中却不同程度的证明禾草内生真菌的侵染可以提高侵染种子的萌发表现［1，5，8］。此外，Casler称，禾草内生真菌的侵染并没有提高植株的抗寒性［66］，而从另一些研究结果［26－28］来看，禾草内生真菌的侵染的确能增强宿主的抗寒性。针对这种差异，有学者进行深入研究后推测，这很有可能是因为相同环境条件下被相同内生真菌感染的植物，其宿主的反应不仅随宿主种、品种而且随同一品种的不同基因型而各不相同［67－68］，与此同时，另一些研究表明，大多数的宿主也只接受单一基因型的内生真菌侵染和共生［69－70］。进一步借助分子系统发育方法构建的系统发育树，也明确地显示禾草与内生真菌有着协同分枝进化关系［71］，这意味着内生真菌同宿主具有一定的不完全相容性，每一种具有开发价值的内生真菌很有可能只能应用于特定的基因型宿主。

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