盐胁迫下黑果枸杞未萌发种子活力探究

罗佳佳， 田 涛， 周 程

（兰州大学生命科学学院， 甘肃 兰州730000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）多年生耐盐、抗旱落叶灌木，生长于盐碱地、沙地、戈壁、路边等，具有强抗逆性，耐干旱、盐碱、寒冷的生物学特征，是改良荒漠化土壤、防风固沙、保持水土的优良植物，具有很高的生态学价值，是世界上三大碱性土壤指示植物和先锋植物之一［1］，枸杞在多地区已经进行育苗实验［2－4］，在中国的人工种植面积也在逐渐扩大［5］。黑果枸杞是我国西北荒漠特有的、亟待开发的野生植物，是盐渍荒漠植被群落中的优势种，具有非常突出的地位和作用，但它属于有性种群，幼苗稀少，其种群已趋于衰败［6］，由于人为过度破坏导致整个生态环境日趋恶化，黑果枸杞资源锐减，资源濒临枯竭，此外，黑果枸杞是枸杞资源中的研究热点［7］，其应用价值较大。基于黑果枸杞的高应用价值和濒临灭绝的现状，对黑果枸杞进行了多方面的研究，主要集中在种子萌发、叶片的解剖结构、营养成分和微量元素、组织培养、多糖的提取、色素等方面［8－9］，其中种子萌发的研究占了很大比重，但这些研究的关键问题是在实验室黑果枸杞种子萌发困难。黑果枸杞种子萌发较难［10］，但有大量研究报道了解除种子休眠的方式［11－12］。参考大量报道后实验室用不同浓度GA3、浓H2SO4、NaOH及不同温度水浴等不同时间浸种预处理，发现浓H2SO4和植物激素是处理硬实种子最好的方法，这与许多其它研究的结果一致，例如：陈海魁和刘克彪对黑果枸杞种子的处理［13，10］以及其他硬实种子敖汉苜蓿［14］、长萼鸡眼草［15］、鸡峰黄芪［16］、白三叶草［17］等的处理。但浓 H2SO4对种子容易造成酸害，且本实验中100mg／L的GA3浸种6h与浓H2SO4的效果相当，故实验选择前者进行种子预处理。实验发现，长时间未萌发的种子表面光鲜、形态圆滑，水分吸收充足显得饱满，无腐烂、发霉等现象。目前，盐胁迫对种子萌发［18－21］以及幼苗生理影响［22－25］的研究已经很成熟。杨志江等的研究表明，NaHCO3和Na2CO3溶液及其造成的碱性环境对黑果枸杞种子的毒害比Na＋小［26］，在NaCl中Cl－对种子也有毒害影响［27］，但对于未萌发种子活力情况的研究在国内外均未曾报道。本实验对黑果枸杞种子进行不同浓度的NaCl协迫，研究了Na＋和Cl－同时作用对黑果枸杞种子的影响，测定萌发率，及未萌发种子活力指标，推究种子难萌发的原因，为解决种子不萌发难题找到突破口，为黑果枸杞的研究奠定基础，为西北地区盐渍土改良及盐地药产业的发展提供理论依据［28］，更有助于发挥黑果枸杞在防风固沙中的先锋作用，增加沙漠地区动植物多样性，维持生态平衡。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验选用采自甘肃民勤且干藏1年的黑果枸杞种子作为实验材料。

1.2 实验方法

种子筛选。种子采用水选法，剔除不饱满的种子以及杂物，使种子均一，做到单一变量原则。将种子浸没于100mg／L的GA3溶液中处理6h。浸种处理后的种子在超净台用自来水洗涤3～5次，后用双蒸水洗涤2次，再用0.1%HgCl2溶液消毒处理10～15min，无菌水洗涤3～5次。

不同浓度培养基制备与处理。实验采用半固体琼脂培养皿发芽法，运用分析纯的NaCl试剂配制琼脂半固体培养基作为支持介质，其浓度分别为0，50，100，150，200，250mmol／L，用120℃高温灭菌配制。将消毒后的黑果枸杞种子均匀接种于培养基中，使种子半陷入培养基，以确保种子能吸收到充足的水分，每个培养皿种子50粒，各处理3次重复。将培养皿置于26℃、湿度适宜的培养箱中，并黑暗处理使种子萌发。每天观察并记录萌发情况，至连续5d以上无新的种子萌发时，表明萌发结束。结束萌发后，观察并记录未萌发种子的形态表现，后将未萌发的种子挑出，用蒸馏水洗涤3～5次，室温晾24h以上使其充分干燥，测定其浸出液电导率和紫外吸光值。称取各处理下黑果枸杞种子0.3g左右，以未经盐处理且具有活力的干种子作为对照，经蒸馏水洗干净后吸干，置于盛有10mL蒸馏水的试管中，室温下浸泡，每隔3h用DDS－11A型电导仪测定种子不同浸泡时间的浸出液电导率［29］，同时每隔6h测定浸出液的紫外吸光值OD260［30］，以上测定均3次重复。

1.3 数据分析

数据采用 Excel、SPSS 19.0等软件进行统计分析及处理，采用LSD法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞种子萌发率的测定结果

各浓度盐胁迫下黑果枸杞种子萌发率均较低，且萌发趋势未呈现规律性变化。由图1可知，与对照（未经NaCl处理）相比，NaCl浓度为100mmol／L的盐胁迫下，种子萌发率最高，且种子萌发盐度耐受范围为0～150mmol／L。

图1 100mg／L GA3 预处理下不同浓度 NaCl（mmol／L）胁迫黑果枸杞种子的萌发率

由图2可知，黑果枸杞种子发芽率低，平均每天发芽种子数不足1粒。对照的种子萌发率最高，达到0.740 7粒／d，但仍未达到1粒／d，而其它盐浓度处理下的种子萌发率则更低。这可能是种子萌发各外在条件未达到最适宜，种子不太适应实验条件，种子自身活力不太高，盐胁迫造成抑制等因素综合所致，具体原因有待进一步探究。

图2 100mg／L GA3 预处理下不同浓度 NaCl（mmol／L）胁迫黑果枸杞种子的平均每天发芽种子数

由图3可知，在无菌寡营养半固体培养基上，黑果枸杞种子萌发情况较差，但萌发后的种子长势较好，幼苗健壮。在黑暗条件以及无营养元素的支持介质上，萌发后的幼苗还能健康生长，这充分说明了黑果枸杞具有强抗逆性，所以黑果枸杞能突破萌发这一关，那么幼苗的生长发育就相对容易。经观察，培养30d后未萌发的种子形态浑圆，表面光滑且有光泽，水分吸收充足而显得饱满，种子颜色仍为深棕色，无腐烂、发霉等现象，可以推测种子可能仍具活力，未死亡。

2.2 不同盐浓度处理下未萌发种子活力鉴定

2.2.1 未萌发种子不同浸泡时间的浸出液电导率

由图4可知，100mg／L GA3预处理后各梯度NaCl浓度胁迫下未萌发种子浸出液的电导率之间呈显著性差异，但电导率并没有随着盐浓度的升高而呈上升趋势，相反在NaCl浓度为200mmol／L时，未萌发种子浸出液电导率最低，且它与对照（干种子）的电导率相比差异不显著（p＞0.05）。NaCl浓度为250 mmol／L时，未萌发种子电导率最高，与对照电导率差异显著（p＜0.05）。与对照电导率相比，NaCl浓度为0，150，200mmol／L的胁迫下，未萌发种子电导率差异不显著（p＞0.05），NaCl浓度为50，100，250mmol／L的胁迫下，未萌发种子电导率差异显著（p＜0.05）且电导率均较大，这些差异显著与否没有规律，没有统一的趋势。依据对比推测，NaCl浓度为0，150，200 mmol／L的胁迫处理下培养30d未萌发的种子仍有活力，有萌发的潜能，但其未能萌发的原因是多方面的，要从种子自身条件和培养条件综合分析。

图3 100mg／L GA3预处理下不同浓度NaCl（mmol／L）胁迫黑果枸杞种子萌发情况

图4 100mg／L GA3预处理接种30d后各处理下未萌发种子浸出液平均电导率［mS／（cm·g）］

2.2.2 未萌发种子浸出液紫外吸光值OD260的测定结果

由图5可知，100mg／L GA3预处理接种30d后各处理下未萌发种子在浸泡时间为6h时，浸出液的OD260均为0，在浸泡12h时对照（干种子）和NaCl浓度为0mmol／L胁迫下，未萌发种子的OD260仍为0，而在18h时NaCl浓度为0mmol／L胁迫下，未萌发种子的OD260也为0，这表明是测量的系统误差，应忽略不计，不予讨论。浸出液OD260随时间出现递增趋势，在浸泡12h时，NaCl浓度为50，250mmol／L胁迫下，未萌发种子的OD260最高，彼此之间差异不显著（p＞0.05）；NaCl浓度为100，150，200mmol／L胁迫下，未萌发种子的OD260最低，彼此之间差异不显著（p＞0.05）。同样，表明OD260未随盐浓度呈现某种趋势性变化，无规律。在浸泡18h时，各处理下未萌发种子的OD260在数值上彼此之间差异不显著（p＞0.05）。

图5 100mg／L GA3预处理接种30d后各处理下未萌发种子浸出液OD260

3 讨论与结论

盐胁迫下种子的发芽情况是评价植物耐盐性的一个重要标志［31］。GA3能够解除种子休眠，促使种子萌发［32］，故本实验运用预实验探究到的最佳浓度为100 mg／L的GA3对种子进行浸种预处理，希望能够提高种子的萌发率。在不同浓度NaCl胁迫中，黑果枸杞种子萌发率总体偏低，平均每天种子萌发数不到1粒（图2），但不同种枸杞的发芽特性不同，其中黑果枸杞萌发率最低［33］，表明黑果枸杞本身具有萌发局限性；整体比较，低浓度NaCl对黑果枸杞种子萌发抑制作用较弱，且适宜低浓度盐分（100mmol／L）对黑果枸杞种子萌发具有促进作用，但随盐浓度的增加，种子的萌发率呈现下降的趋势，这与王桔红等［31］、毛桂莲等［34］的研究结果一致，说明GA3对种子萌发的促进作用未能很好的抵消阻碍黑果枸杞种子萌发的负因素。本实验表明，黑果枸杞种子最适萌发盐浓度为100mmol／L，耐受盐度为0～150mmol／L。而陈海魁等的研究表明，NaCl浓度在0.3%～0.4%之间黑果枸杞种子的萌发率最高，随后随盐浓度的增加萌发数逐渐减少［35］。这可能是实验温度、仪器、操纵人员等实验条件的不同造成了差异。

本实验萌发种子形成的幼苗在寡营养的培养基以及黑暗环境条件下生长健壮。王龙强等的研究也表明，宁夏枸杞和黑果枸杞在盐胁迫下光合色素、脯氨酸和可溶性糖的含量均高于对照［36－37］，均表明黑果枸杞的强抗逆性。同时，观察未萌发的黑果枸杞种子发现，种子圆润、饱满且仍为深棕色，无腐烂、发霉等表现（图3），故只要解决种子萌发的大难题，黑果枸杞在恶劣的环境中生长发育就相对容易。介于黑果枸杞种子萌发不太理想，故准确地研究实验未萌发种子存在活力与否便成必然。存活率、K＋／Na＋、丙二醛含量、脯氨酸含量是植物幼苗耐盐性指标筛选的通用指标［38－40］，但这些指标对种子均不实用，电导法和分光光度法是一种简便、快速、客观的活力测定方法［30，41］，依据本实验对象（未萌发的种子）的情况，选择电导率测定和紫外分光光度法法测定种子活力。本实验以干种子作对照，测得100mg／L GA3浸种预处理的种子在不同浓度NaCl胁迫培养下未萌发种子的电导率和OD260并不随盐浓度变化呈现规律性变化，反而在低盐度处理下电导率和OD260出现较高的情况。由图4可知，未萌发种子浸出液电导率先随胁迫的NaCl浓度0～100mmol／L升高而升高，再随浓度100～200 mmol／L升高而降低，最后随浓度200～250mmol／L升高而升高，其中NaCl浓度为50～100mmol／L时，电导率较高，且与最高电导率和最低电导率差异显著（p＜0.05）；NaCl浓度为150～200mmol／L时，电导率最低；NaCl浓度为250mmol／L时，电导率最高；由图5可知，浸泡12h时，未萌发种子浸出液OD260随NaCl浓度50～250mmol／L的升高呈现先降低后升高的趋势。同时，OD260在 NaCl浓度为50～100mmol／L、150～200mmol／L、250mmol／L这3个阶段其值与电导率呈现相同的规律；浸泡18h时，各OD260值在不同NaCl浓度胁迫下差异不显著（p＞0.05）。

结合图4和图5的规律分析，可推测未萌发种子在较低NaCl浓度（50～100mmol／L）胁迫下活力较低；在中等 NaCl浓度（150～100mmol／L）胁迫下活力最高，且活力与干种子活力差异不显著（p＞0.05）；在最高NaCl浓度（250mmol／L）胁迫下活力最低。表明黑果枸杞种子在耐受盐度0～150mmol／L的胁迫下，长时间未萌发的种子仍保持活力。

研究表明，盐胁迫下脯氨酸和可溶性糖在根中的含量最高［37，42］，幼根在特定根段会迅速积累 Na＋和Cl－［43］。姜霞等的研究也表明，黑果枸杞根的耐盐能力比茎和叶差［44］。在胁迫下，黑果枸杞种子根耐盐性较差，生根困难，但种子仍保持活力，可能会等到适宜的条件再度萌发，这可能与其生存对策有关［45］。这种现象除与外界环境相关外，还与其遗传因子相关［46］。不同枸杞种的抗逆性有差异，其所含种子蛋白也不同，具有特征蛋白质［47］。所以下一步工作是对种子进行抗逆蛋白、抗衰老因子等分子水平的研究，从根本上解决黑果枸杞种子难萌发的问题。

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