鸡碱性氨基酸转运基因调控区多态性对生产性状的影响

鸡碱性氨基酸转运基因调控区多态性对生产性状的影响

王政，郭文婕，邢颖，罗榕，朱芷葳，张利环，李慧锋*

(山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

摘要：鸡小肠上皮细胞中一些营养转运基因的表达变化会影响到肠道对饲料中营养的吸收能力，导致个体间体重、饲料转化率等生产性状的差异。为了研究营养转运基因调控区不同的单核苷酸多态位点导致的基因表达差异及对相关生产性状的影响，本试验对黄羽肉鸡群体中碱性氨基酸转运载体rBAT和y+LAT1基因5’调控区中的SNP位点进行了筛查，并对不同基因型对多个生产性状的影响进行了比较分析。结果发现rBAT基因上游900 bp内存在12个SNP位点,在y+LAT1基因上游1 000 bp内存在4个SNP位点。经统计分析，rBAT基因上游T-188C位点的CC型个体的70日龄体重、摄食量和体重增量显著比TC型和TT型个体高(P<0.05)。y+LAT1基因上游G-872A位点的GG型个体的49日龄体重显著比AG型个体高(P<0.05)，而AA型和AG型个体比GG型个体具有更高的饲料利用率(P<0.05)。研究结果为进一步研究rBAT和y+LAT1基因的功能以及其多态性位点调控表达的功能奠定了基础。

关键词：黄羽肉鸡；rBAT；y+LAT1;SNP；生产性状

收稿日期：2015-08-15修回日期：2015-09-10

作者简介：王政(1990-)，男(汉)，山西太原人，硕士，研究方向：生物化学和分子生物学

通讯作者：*李慧锋，副教授，硕士生导师。Tel:15934425236;E-mail: lihuifengtom@163.com

基金项目：国家自然科学基金(31172203)

中图分类号：Q754文献标识码：A

Effects of Polymorphisms of Regulatory Region of Cationic Amino Acid Transporters Genes on Production Traits in Chicken

Wang Zheng， Guo Wenjie， Xing Ying， Luo Rong， Zhu Zhiwei， Zhang Lihuan, Li Huifeng*

(CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801,China)

Abstract:The expression of multiple genes in intestinal epithelium cells (IEC) affect the absorption of nutrients in chicken small intestine，which lead to the individual differences on body weight(BW), feed conversion rate(FCR) and other production traits. In order to evaluate the effects of single nucleotide polymorphism (SNP) in the regulatory region of nutrition transporter genes on the production traits，we screened SNPs in the 1 000 bp upstream regulatory region of two cationic amino acid transporters (rBAT、y+LAT1) in yellow meat-type chicken population and analyzed the effects of different genotypes on the BW, BWG, FI and FCR. The results showed twelve SNPs in the regulatory region of rBAT and four SNPs in the regulatory region of y+LAT1. Furthermore, birds with the CC genotype of T-188C loci of rBAT showed strongly higher BW70, BWG and FI (P<0.05) compared with TC and CC individuals. For y+LAT1, individuals with the GG genotype of G-872A loci had significantly higher BW49 (P<0.05) than those with the AG genotype, whereas the AA and AG genotypes had the significantly lower FCR (P<0.05) compared with GG genotype. The result in this study suggests the need for further functional study on the role of rBAT and y+LAT1 genes in production traits of chickens and laid the foundation for SNP regulating genes expression.

Key words:Yellow meat-type chicken； rBAT； y+LAT1； SNP； Production traits

黄羽肉鸡在我国家禽养殖中占有非常重要地位[1]。黄羽肉鸡的整个生长期中，体重增量会逐渐减小，饲料利用率逐渐下降[2]。饲料成本占总饲养成本的70%。提高饲料利用率不仅能降低饲养成本而且可以降低养殖过程造成的环境污染[3]。黄羽肉鸡的生产性状除了受环境的制约更主要受到多种基因的调控，其中营养转运蛋白是影响生长发育的重要候选基因，在肉鸡养殖中有效利用候选基因上的分子标记可以极快提高育种进程。

鸡饲料的营养主要来源是碳水化合物和蛋白质，它们产生的能量构成了生命活动的基础。鸡孵化后的营养结构与营养吸收效率在维持生命、促进生长发育以及生产效率方面发挥着重要作用[4]。由于肉鸡对糖的有效利用率相对恒定[5]，蛋白质的吸收效率成为营养有效利用的另一个重要指标。蛋白质在体内首先经过消化酶分解形成单个氨基酸或多肽，游离的氨基酸通过小肠上皮细胞从肠腔进入到血液[6]。此过程的完成依赖小肠上皮细胞中存在的多种氨基酸转运蛋白。它们是游离的氨基酸进出细胞、完成细胞功能的通道。这些氨基酸转运基因存在的遗传突变，会影响肠道对氨基酸吸收效率以及吸收后利用效率[7]。

20 种基本氨基酸中赖氨酸、精氨酸、组氨酸均为肉鸡所必需的碱性氨基酸，而且参与着许多重要代谢过程[8]。碱性氨基酸在肠道内的吸收主要由y+、b0,+和y+L三类氨基酸转运系统协同完成。b0,+和y+L氨基酸转运系统的成员均是重链和轻链组成的异二聚体结构。 rBAT-b0+AT异二聚体氨基酸转运蛋白是b0+家族在小肠上皮细胞刷状缘膜存在的主要成员，其中重链rBAT由SLC3A1基因编码，是细胞膜上的II型膜糖蛋白承担着物质转运功能,而b0+AT是轻链由SLC7A9编码作为催化亚基存在[9]。rBAT-b0+AT氨基酸转运蛋白负责从肠腔面吸收碱性氨基酸和胱氨酸,转出中性氨基酸。y+L转运系统中，轻链y+LAT1(SLC7A7)和重链4F2hc(SLC3A2)构成的异二聚体转运蛋白在小肠和肾小管的上皮组织中特异表达，它与rBAT-b0+AT结构类似，同样属于反向交换转运蛋白，负责从胞外转入中性氨基酸同时转出胞内的碱性氨基酸[10]，两种转运蛋白分别位于小肠上皮细胞的顶膜和基底膜，协同完成肠腔向血液的碱性氨基酸运输[11]。

本实验以碱性氨基酸转运载体rBAT和y+LAT1基因5’调控区作为研究对象，从基因侧翼区中多态性位点对基因转录水平的表达调控影响出发，探究SNP不同基因型对生产性状影响的差异，为验证调控区的SNP的功能奠定了基础,并为直接利用基因型选育生长良好和生产性能高的黄羽肉鸡提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验群体及性状采集

本实验研究群体是由广州温氏南方家禽育种中心提供的黄羽肉鸡群体，是第22代育种群。实验鸡均同批次孵化，整个饲养过程都是室内饲养自由采食。42日龄时，分群进行单笼饲养，记录每只鸡49和70日龄体重(body weight，BW)以及之间的摄食量(feed intake，FI)。数据由温氏南方家禽育种中心提供。依据体重和摄食量数据计算出49到70日龄的体重增量(body weight gain，BWG)和饲料转化率(feed conversion ratio，FCR)。其中72只黄羽肉鸡由于缺少相关表型数据被舍弃。

1.2样本的筛选

实验群体FCR数据经SPSS统计服从正态分布N(2.89，0.262)如图1。在群体FCR<2.40和FCR>3.50区域内分别选取12个样本，定为低FCR样本组和高FCR样本组，用于寻找可能影响生长生产性状的SNP位点。

图1　总体饲料转化率分布图 Fig.1　The distribution of FCR in total population

从欧洲生物信息学研究所数据库(Ensembl)获得rBAT和y+LAT1基因的上游1 000 bp序列，使用Primer3.0进行引物设计(表1), 并利用在线网站(http://www.gene-regulation.com)研究SNP位点所在区域的转录因子结合差异。

1.3PCR测序检测SNP基因分型

通过酚-氯仿抽提法从育种中心提供的血样中得到基因组DNA，使用超微量分光光度计将DNA浓度确定到300 mg·L-1，使用表1中rBAT和y+LAT1基因的引物在高FCR样本组和低FCR样本组进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳检测，后送到华大基因进行全部测序，通过峰图确定相应变异位点的基因型。

表1　检测 rBAT和 y+ LAT1基因上游SNPs的引物

1.4数据统计与分析

将高低两个FCR样本组混合成一个总样本群，利用统计学软件SAS 8.1中的方差分析(ANOVA)检验总样本群中每个SNP的不同基因型对体重、摄食量、体重增量、饲料转化率的效应进行差异显著性检验，P<0.05判定为差异显著，P>0.05为差异不显著。分析结果用最小二乘平均值±标准误表示。

2结果与分析

2.1PCR产物电泳结果

采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定rBAT和y+LAT1基因上游片段扩增产物，均能获得与目标片段大小一致的产物(图2)。产物条带清晰无杂带，可直接进行测序分析。

2.2SNP位点的统计

将表1中两对引物在24个样本中扩增获得的PCR扩增产物进行测序。由于实验将扩增产物进行测序，片段上下游50 bp存在机读误差，测序结果不准确，所以选取中间部分进行比对。经测序峰图比对，在rBAT基因上游900 bp内共发现12个SNP位点(图3)，在y+LAT1基因上游1 000 bp内共发现4个SNP位点(图4)。将获得的SNP位点的数据上传到NCBI中的SNP数据库(dbSNP)获得部分SNP编号(附录1)。

图2　rBAT和y+LAT1上游部分片段琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.2　Electrophoretic products of partial fragments of rBAT and y+LAT1 upstream region 注：M代表2000marker；1和5泳道为y+LAT1扩增产物；2,3,4泳道代表rBAT扩增产物 Note：M:DL2000 Marker; 1,5:y+LAT1; 2,3,4:rBAT

图3　rBAT基因上游900 bp内SNP位点图 Fig.3　The SNPs of 900 bp upstream of rBAT

图4　y+LAT1基因上游1 000 bp内SNP位点图 Fig.4　The SNPs of 1 000 bp upstream of y+LAT1

2.3SNP不同基因型间差异显著性分析

利用统计学软件SAS 8.1中的方差分析(ANOVA)检验总样本群中每个SNP位点的不同基因型对49日龄体重、70日龄体重、摄食量、体重增量、饲料转化率影响的差异显著性。结果表明在rBAT基因上游-188 bp处存在SNP位点(T-188C)为T和C间的转换，TT,TC,CC三种基因型对70日龄体重，摄食量和体重增量的影响存在显著性差异(P<0.05，表2)，CC型虽然数量较少，但在70日龄体重、摄食量和体重增量显著比TC型和TT型个体高(P<0.05)，而TT型与TC型之间不存在显著性差异(P>0.05，表3),对三种基因型间均值比较，发现在T-188C位点中CC型个体比TC型个体拥有着极佳的生产状态，而TC型个体又比TT型个体生长良好，表明在此位点对生长性状存在一定影响。在y+LAT1基因上游-872 bp处存在SNP位点(G-872A)为G和A间的转换，AA,AG,GG三种基因型对49日龄和饲料转化率的影响差异显著(P<0.05，表2)，GG基因型个体显著比AG型个体在46日龄体重高(P<0.05),而AG和AA基因型个体饲料转化率显著低于GG型个体(P<0.05，表3)，虽然基因型在70日龄体重，体重增量和摄食量中并不存在显著差异，但从基因型效应的均值比较中发现GG型个体的生产性状比AG和AA型个体更加优良。

表2　 rBAT和 y+ LAT1基因部分上游多态性在总样本群中对生产性状的方差分析

注：差异显著*P<0.05；差异极显著 **P<0.01。

Note：*P<0.05; **P<0.01.

表3　T-188C and G-872A位点在总样本群中对生产性状的影响(平均值±标准误)

注：不同字母表示均值差异显著(P<0.05)

Note：Means within a row lacking a common superscript differ (P<0.05)

3讨论与结论

肉鸡对氨基酸的摄取量决定其最佳生长状态，饲料中的蛋白质中除了一些分解为氨基酸被用于代谢产物前体、信号分子等方面，还会存在一定的蛋白沉积，这些过量的蛋白分解成的氨基酸作为能源物质被利用，它产生的能量比葡萄糖完全氧化产生的还要高，氨基酸摄入量的降低更会导致仔鸡摄食量的减少，在机体内的作用是其他营养物质不可替代的[7]。小肠不仅是营养物质吸收的主要场所，也是调控营养平衡以及饲料利用的关键信号分子的集中表达部位，小肠对营养物质的吸收主要依赖于细胞膜中存在的大量营养转运蛋白，这些营养转运蛋白的类型和数量直接影响了动物组织对于饲料成分的吸收。在基因结构中，非编码区存在大量未探索的SNP，它们通过影响转录因子的结合活性对基因表达的调控起重要作用[12]。本实验在黄羽肉鸡群体中对小肠上皮细胞顶膜中起碱性氨基酸转运作用的rBAT基因上游900 bp调控区序列测序分析，发现了12个SNP，对小肠上皮细胞基底膜中起碱性氨基酸转运作用的y+LAT1基因上游1 000 bp调控区序列测序分析，发现4个SNP位点。

rBAT是小肠和肾小管上皮顶膜上均有表达的一种碱性氨基酸转运载体，它与b0+AT通过二硫键耦合形成的异二聚体在不依赖钠离子的情况下向细胞内高亲和力转运碱性氨基酸，并向胞外转运出中性氨基酸，并且是胱氨酸向胞内转运的主要载体[9]。Gilbert在对肠道内营养转运蛋白含量研究中发现rBAT基因在孵化后的mRNA表达量不会发生较大改变，并且在品系不同的种群中表达量也没有较大差异，其中回肠中rBAT基因的mRNA表达量比空肠和十二指肠更高[7]，这与谭会泽的研究结果一致[8]。在以往的研究中此基因的突变会导致小肠上皮细胞对胱氨酸吸收减少和肾小管上皮细胞的重吸收能力减小，大量的胱氨酸随尿排出，导致胱氨酸沉淀，由于胱氨酸溶解性差极易形成结石，诱发胱氨酸尿症，最终导致发育减缓，代谢速率降低[13]。本实验探究了rBAT基因上游900 bp序列内存在的SNP位点并对不同基因型在多个生产性状中的影响进行了多重比较，发现T-188C位点中CC基因型个体在70日龄体重、摄食量和体重增量方面显著比TC型和TT型个体高(P<0.05)，三种基因型间均值的比较发现CC型个体比TC型个体拥有着极佳的生产性状，而TC型个体又比TT型个体生产性能良好，说明此位点为C碱基时对生产性状有着更大的影响。对此SNP上存在的转录因子分析，同样发现当该位点为C时，有GATA1转录因子的结合,当为T时，GATA1转录因子结合位点消失。GATA1是GATA转录调控蛋白家族中的一员具有锌指结构[14]。在动物胚胎生长发育时期，GATA家族通过结合调控区顺式作用元件家族在胃肠道生长发育过程中起到促进的作用，并在成年动物肠上皮的更新中起着调节组织分化的作用。T-188C位点可能通过碱基的转换影响了rBAT基因的表达量，进而对表型造成一定改变。

y+LAT1是小肠和肾小管基底膜上表达的一种碱性氨基酸转运载体，与4F2hc形成的异二聚体在钠离子的协助下，向细胞内转入中性氨基酸的同时按1∶1的比例反向交换转出细胞中的碱性氨基酸，这个过程不仅补偿了rBAT-b0+AT异二聚体向胞外转出的中性氨基酸，更刺激了肠道对碱性氨基酸吸收速率[15]。小肠中y+LAT1基因mRNA的表达量从 20日龄的胚胎到孵化后14日龄呈线性减少[7]。在过往的研究中，发生在y+LAT1基因的突变会导致赖氨酸尿性蛋白不耐症，这是由于y+LAT1基因突变引起上皮细胞基底膜的转运缺陷，造成小肠内极性细胞对碱性氨基酸转运量减少，甚至非极性细胞膜中不存在该转运蛋白，引起碱性氨基酸肾排泄增加，尿素循环功能障碍，肝脾肿大最终导致生长停滞[16]。本实验探究了y+LAT1基因上游1 000 bp序列内存在的SNP位点并对的不同基因型在多生产性状的影响进行了多重比较。发现在G-872A位点中GG基因型个体46日龄体重显著比AG型个体高(P<0.05),而AG和AA基因型个体饲料转化率显著低于GG型个体(P<0.05)，基因型间均值比较发现GG型个体在体重方面比AG和AA型个体有着独特的优势，而AA型和AG型个体比GG型个体显示出更高的生产效率。对其进行转录因子结合情况的分析，当该位点为G时,出现CDXA转录因子的结合位点,当该位点为T时，CDXA转录因子结合位点消失。CDXA属于同源异形盒家族具有螺旋-转角-螺旋结构，通过结合调控区序列对下游基因产生调控作用，CDXA主要集中在小肠和小肠隐窝中表达，能促进上皮细胞的生长和分化[17]。因此G-872A位点可能通过碱基转换改变了CDXA结合能力，进而影响了生产性状。

本实验对rBAT和y+LAT1基因上游调控区SNP多态性位点进行了筛查以及其影响调控表达的机理进行了细致的研究，并就一些位点对生产性状的影响进行了分析讨论。未来的研究需要在rBAT和y+LAT1基因对生长饲养的作用以及多态性位点调控表达的功能进行更深的探索。

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(编辑：马荣博)