绵羊ANGPTL4蛋白在脂肪组织中的表达研究

绵羊ANGPTL4蛋白在脂肪组织中的表达研究

张静，张方，胡子乔，潘洋洋，乔利英，刘文忠*

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

摘要：血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是一种与脂肪代谢相关的分泌性蛋白。本研究利用Western blotting 技术检测了两个不同品种的脂尾型绵羊，即广灵大尾羊和小尾寒羊的2、4、6、8、10和12月龄时的母羊(每年龄段2只)，共24个个体的皮下、腹膜后、肾周和尾部脂肪组织的ANGPTL4蛋白的表达量。结果表明：品种、月龄和组织对ANGPTL4蛋白的表达都有极显著(P<0.001)影响。品种与月龄的互作对该蛋白表达也有显著(P<0.01)影响。本研究结果为进一步探讨ANGPTL4蛋白在绵羊脂肪组织中的作用机制提供了理论依据。

关键词：绵羊；ANGPTL4蛋白；脂肪组织；Western blotting；表达

收稿日期：2015-09-24修回日期：2015-10-18

作者简介：张静(1992-)，女(汉)，山西怀仁人，硕士研究生，研究方向：脂肪代谢相关基因

通讯作者：*刘文忠，教授，博士生导师。Tel：0354-6288337；E-mail：tglwzyc@163.com

基金项目：国家自然科学基金 (30972084)；山西农业大学青年学术带头人项目(XD201205)；山西省科技攻关项目(011029)

中图分类号：S826文献标识码：A

Expression of ANGPTL4 in Ovine Adipose Tissues

Zhang Jing1, Zhang Fang, Hu Ziqiao, Pan Yangyang, Qiao Liying, Liu Wenzhong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:Angiopoietin-like protein 4 (ANGPTL4) is a kind of secretory protein related to fat metabolism. (Objective) To detect the expression of ANGPTL4 protein in different adipose tissues of two breeds with distinct fat tail, adipose tissue samples from subcutaneous, retroperitoneal, perirenal and tail fats were collected from twenty-four females in six age groups and from two breeds, i.e. Guangling Large Tailed (GLT) and Small Tailed Han sheep (STH) were detected by Western blotting in this study. The results showed that breed, month of age and adipose tissues influence ANGPTL4 protein expression significantly (P<0.001). Significant interaction (P<0.01) between breed and month of age was also obtained. These results provide theoretical bases for mechanism of ANGPTL4 protein in ovine adipose tissues.

Key words:Sheep; ANGPTL4 protein; Adipose tissues; Western blotting; Expression

ANGPTL4蛋白是一种由ANGPTL4基因编码，与血管生成相关的蛋白。作为分泌蛋白，ANGPTL4含有一个信号肽，一个N端卷曲螺旋的四级结构(coiled-coil domain, CCD)和一个C端纤维蛋白原结构域(fibrinogen-like domain, FLD)[1,2]。CCD介导同源寡聚体的合成，也可以抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的活性[3]，跨膜域的酶切可增强抑制作用[4]。而FLD可调节配体的活性，可能与蛋白质间的互作有关。

ANGPTL4由很多组织分泌，但主要以肝脏和白色脂肪组织为主。该蛋白分子量在45～65 kDa，且以多种形式存在于不同组织。人和小鼠血浆中的ANGPTL4以全长和截短两种形式存在。小鼠3T3-L1脂肪细胞中，只能检测到截短的ANGPTL4。人类WAT中只有全长形式存在，而肝脏只分泌截短型蛋白[1]。血浆中的ANGPTL4主要以截短型存在[5]。一些前蛋白转化酶，如枯草杆菌蛋白酶(proprotein convertase subtilisin/ kexin type3, PCSK3)，弗林蛋白酶(furin)和蛋白质转换酶(proprotein convertase 5/6, PC5/6)等可通过识别特定的氨基酸序列R161RKR164水解ANGPTL4蛋白[4,6]。

小鼠ANGPTL4蛋白主要在白色和棕色脂肪组织中表达，在卵巢、心脏、肝脏、骨骼肌、肠[7,8]、下丘脑、皮质和垂体[9]中都有表达。人ANGPTL4蛋白广泛表达，在肝脏、脂肪、血浆、胎盘、小肠和心脏中高表达[8,10]，但存在明显的个体差异[5,11]。

本研究利用Western blotting技术对绵羊ANGPTL4蛋白在两个不同脂尾型绵羊中的差异表达进行研究，旨在为进一步探讨ANGPTL4在绵羊脂肪代谢中的作用机制提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

ANGPTL4单克隆兔抗购自Abcam公司(英国)，(-actin兔抗，山羊抗兔IgG，哺乳动物组织蛋白提取试剂，PMSF，BCA蛋白定量试剂盒，凝胶蛋白质快速蓝染试剂盒，硝酸纤维素NC膜，Tween 20，印迹膜丽春红染液，彩色预染中分子蛋白质分子量标准和超敏ECL化学发光即用型底物均购自武汉博士德生物工程有限公司。Tris、SDS、N,N′-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、丙烯酰胺、溴酚蓝、甘氨酸、无水乙醇、NaCl和脱脂奶粉均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2试验动物与样品采集

本研究以广灵大尾羊和小尾寒羊为研究对象。分别屠宰两个品种2、4、6、8、10和12月龄时的母羊，每年龄段2只。采集共24个个体的皮下、腹膜后、肾周和尾部脂肪组织，立即用灭菌锡箔纸包好，迅速放入液氮中备用。

1.3蛋白质提取和Western blotting试验步骤

参考哺乳动物组织蛋白提取试剂和PMSF试剂说明书提取组织蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒对所提蛋白进行定量浓度检测。按照每个样品总蛋白上样量为30 μg来计算各组织蛋白样品所需上样体积，在蛋白样品中加入适量的5×SDS-PAGE上样缓冲液，使其工作浓度为1×，最后用去离子水补齐至10 μL。将制备好的蛋白样品放入金属浴中约10 min，使蛋白完全变性，解聚。制备好SDS-PAGE凝胶后，将变性后的蛋白样品加入点样孔后进行电泳。电泳条件为80 V，40 min，120 V，90 min。电泳后采用湿转法将蛋白转到硝酸纤维素NC膜上。用TBST清洗3次后，再用蒸馏水清洗3次，放入2%的脱脂奶粉中封闭约1.5 h。将含有目的条带的膜孵育ANGPTL4单克隆兔抗，内参条带的膜孵育为β-actin兔抗，4 ℃过夜。次日取出后，用TBST清洗3次，再用蒸馏水清洗3次，将两张膜均放入山羊抗兔IgG中孵育约2 h，用TBST清洗3次后，再用蒸馏水清洗3次。使用超敏ECL化学发光即用型底物对两张膜进行曝光拍照处理，并记录结果。

1.4Western blotting试验结果分析

应用Image Lab软件对成像之后保存的图片进行结果分析。测定目的条带面积和灰度值。将目的蛋白与内参蛋白进行对比，应用下列公式进行半定量分析。

蛋白含量=条带面积×平均灰度值

目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量

1.5数据处理与分析

用SPSS 17.0软件(SPSS Science, Chicago, IL, USA)中一般线性模型(general linear model, GLM)过程对绵羊ANGPTL4蛋白相对表达量进行单变量方差分析。试验考虑的主效应有品种、月龄和组织，二阶互作效应为3个主效应两两间的互作。配合模型如下：

yiklm= μ+Bi+Tk+Ml+BTik+BMil+

TMkl+eiklm

式中，yiklm为绵羊ANGPTL4蛋白相对表达量，μ为总体均值；Bi为第i个品种效应(i=1,2)；Tk为第k种脂肪组织效应(k=1, 2, …, 4)；Ml为第l个月龄效应(l=2, 4, …, 12)；BTik、BMil和TMkl表示两因素互作效应；eiklm为残差。用Duncan(s法对各因素不同水平间的差异进行多重比较。

2结果与分析

2.1脂肪组织中总蛋白

蛋白质样品的质量会直接影响后续试验的成功与否。图1为本试验提取的蛋白质样品的SDS-PAGE垂直电泳图。本试验的目的蛋白分子量为50 kDa，内参蛋白分子量为43 kDa。由图可知，蛋白样品经电泳分离后，条带明显、整齐清晰且完整无缺失。表明蛋白质样品和SDS-PAGE电泳中的分离胶和浓缩胶浓度均符合试验要求。条带无明显的粗细不均匀，表明蛋白质上样量统一合理。图2为曝光后的部分条带图。图3为两品种6个年龄段的ANGPTL4蛋白相对表达量。

2.2ANGPTL4蛋白相对表达量与影响因素

2.2.1影响ANGPTL4蛋白表达量的因素

方差分析(表1)可知，品种、月龄和组织均极

图1　SDS-PAGE电泳分离条带后反应的总蛋白提取效果 Fig.1　The gel electrophoresis bands of extracted total protein by SDS-PAGE

图2　部分Western blotting条带图 Fig.2　Western blotting bands of ANGPTL4 from different tissues

图3　两品种6个年龄段的ANGPTL4相对表达量 Fig.3　ANGPTL4 relative expressive abundances in six ages of two breeds

显著(P<0.001)地影响ANGPTL4蛋白的表达。品种与月龄的互作也显著(P<0.01)影响该蛋白的表达量。

2.2.2ANGPTL4蛋白的表达丰度

表2给出了绵羊ANGPTL4蛋白在不同品种、组织和月龄中的表达量。从品种上来看，

表1　 ANGPTL4蛋白表达丰度的方差分析

NS: Not significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

ANGPTL4蛋白在小尾寒羊中的表达量(0.308)显著(P<0.001)低于广灵大尾羊(0.716)。从组织来看，ANGPTL4在4种脂肪组织中的表达量差异显著(P<0.001)。皮下脂肪中的表达量(0.755)最高，且显著高于(P<0.001)其他组织。其次是尾脂(0.573)，肾周脂肪组织表达量最低(0.285)。从月龄来看，10月龄时的ANGPTL4蛋白表达量最高，且显著(P<0.001)高于其他月龄。12月龄次之。8月龄(0.579)、4月龄(0.448)、6月龄(0.446)逐渐降低，2月龄时表达量最低(0.166)。

表2　绵羊ANGPTL4蛋白表达丰度

*不同字母表示同一因素不同水平间差异显著(P<0.05)。

* Values with different superscripts within the same factor differ significantly (P<0.05).

二因素互作中，品种与月龄的互作对ANGPTL4蛋白表达有显著影响(P<0.01)。由图4可知，ANGPTL4蛋白受品种与月龄互作的影响主要来源于小尾寒羊中6月龄的表达量低于4月龄，12月龄的表达量稍高于10月龄。但广灵大尾羊6月龄表达量高于4月龄，而在12月龄的表达量显著低于10月龄，与小尾寒羊的情况正好相反。

图4　二因素互作对绵羊ANGPTL4蛋白表达的影响 品种：1 小尾寒羊；2 广灵大尾羊 Fig.4　Effects of two-way interactions on the expression of ovine ANGPTL4 protein Breed: 1 Small Tailed Han (STH); 2 Guangling Large Tailed sheep (GLT)

3讨论

3.1ANGPTL4蛋白的表达

ANGPTL4蛋白在不同的物种中表达略有差异。大量研究表明ANGPTL4蛋白最初在脂肪细胞中分泌表达，在肝脏、心脏和骨骼肌中高表达[12～15]。小鼠的ANGPTL4蛋白主要在脂肪组织中表达(包括白色和棕色脂肪组织)，在肝脏和下丘脑中也有表达[16]。而人的ANGPTL4蛋白则广泛表达[5,8]。就脂肪组织来看，不同脂肪组织中的ANGPTL4蛋白表达丰度也不尽相同。Dutton等[17]对小鼠研究发现，ANGPTL4蛋白在5种脂肪组织中都有表达，其中皮下脂肪中的表达量低于附睾和肾周脂肪组织中的表达量。经免疫组织化学染色发现，人的ANGPTL4蛋白在网膜中表达，但皮下和乳腺脂肪组织中不表达[18]。本研究中，绵羊ANGPTL4蛋白在4种脂肪组织中均有表达，且皮下脂肪中表达量最高。这与人和小鼠中的研究略有不同。可能是由于该蛋白的表达在物种间存在差异性。皮下是储存脂肪的重要部位，由此可说明ANGPTL4蛋白有利于绵羊皮下脂肪的沉积。对绵羊的定向培育也可能是导致绵羊皮下脂肪沉积量显著高于其它组织的原因。

3.2影响ANGPTL4蛋白表达的因素

品种对绵羊ANGPTL4蛋白的表达有显著影响。本试验中，广灵大尾羊ANGPTL4蛋白的表达量显著高于小尾寒羊。ANGPTL4通过抑制脂蛋白脂肪酶的活性引起甘油三酯的沉积。可见，广灵大尾羊较小尾寒羊有更强的脂肪沉积能力[19,20]。Feng等[21]对肥胖型和瘦肉型猪的研究发现，ANGPTL4在肥胖型猪中的表达量高于瘦肉型猪中的表达量。说明ANGPTL4蛋白在不同物种中，都具有促进脂肪沉积的作用。

季节对ANGPTL4蛋白表达也有显著的影响。本研究中，2月龄到6月龄实际对应于1月到5月，该时间段为枯草季。8月龄到12月龄实际对应于7月到11月，为青草季节。在10月龄时对应于9月份，牧草丰富，进食量大。此时ANGPTL4蛋白的表达丰度最高，抑制脂蛋白脂肪酶的活性，导致脂肪的沉积。在2月龄时(即1月份)羊群进食量明显减少，ANGPTL4蛋白表达量最低，脂肪沉积量也降低。

4小结

本文利用PCR-SSCP的方法对广灵大尾羊和小尾寒羊两品种的ANGPTL4蛋白相对表达量进行研究。发现品种、月龄和组织对ANGPTL4蛋白的表达都有极显著(P<0.001)影响。品种与月龄的互作对该蛋白表达也有显著(P<0.01)影响。

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(编辑：武英耀)