转基因HBV小鼠急性肝损伤的生物学特性研究

转基因HBV小鼠急性肝损伤的生物学特性研究

魏琴1,2， 姜涛2， 苗娜3， 张春2， 李志强2， 寿玺2， 马嵋2， 丁剑冰1

(新疆医科大学1基础医学院免疫学教研室， 乌鲁木齐830011；2第一附属医院新疆医学模型动物研究重点实验室；

3第一附属医院病理科， 乌鲁木齐830054)

摘要:目的研究四氯化碳(CCL4)诱导转基因乙型肝炎病毒(HBV)小鼠急性肝损伤的生物学特性的改变。方法选取32只健康雄性C57BL/6小鼠作为空白对照组，实验组：选用32只健康雄性C57BL/6小鼠作为CCL4干预组，32只健康雄性HBsAg表达阳性C57BL/6-HBV转基因小鼠为HBV+CCL4干预组。空白对照组按0.5 mL/kg腹腔注射橄榄油溶液，于0、24、48、72 h 4个时间点取标本。实验组每组各留8只作为空白对照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄榄油溶液，0 h处死；其余24只各自随机分组，一次性给予0.5 mL/kg腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液，分别于24、48、72 h每组随机挑选8只小鼠，采集标本，全血用于计数白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)，取血清测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。结果与空白对照组比较，CCL4干预组24 h AST、ALT明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；HBV+CCL4干预组与CCL4干预组相比，AST、ALT水平在损伤24 h达到峰值，且差异有统计学意义(P<0.01)； CCL4干预组和HBV+CCL4干预组24 h时WBC均呈现下降，且两组差异有统计学意义(P<0.05)；HBV+CCL4干预组RBC在24、48、72 h均降低，与0 h比较差异有统计学意义(P<0.05)；HBV+CCL4干预组PLT 在48、72 h均降低，与0 h比较差异有统计学意义(P<0.05)。HBV转基因小鼠在CCL4诱导下24 h AST、ALT显著升高，WBC、RBC、PLT均降低；ALP、TP、ALB无明显差异，这些指标的改变符合急性肝损伤模型的标准。结论成功建立HBV转基因小鼠急性肝损伤模型，为进一步研究急性肝损伤的发病机制及其他变化提供了可靠的实验平台。

关键词：HBV转基因小鼠； 四氯化碳； 急性肝损伤；

中图分类号：R392文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.013

[收稿日期：2014-12-04]

Study on the biological characteristics of HBV transgenic mice with acute liver injury

WEI Qin1,2， JiANG Tao2， MIAO Na3， ZHANG Chun2， LI Zhiqiang2， SHOU Xi2，

MA Mei2， DING Jianbing1

(1DepartmentofImmunology，BasicMedicalCollege，XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011，China;2XinjiangKeyLaboratoryofMedicalAnimalModelResearch;

3DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological characteristics of acute liver injury in mice induced by transgenic hepatitis B virus (HBV) by carbon tetrachloride (CCL4). Methods32 male C57BL/6 mice were the control group; 32 male C57BL/6 mice were the CCL4 group; 32 male transgenic C57BL/6 mice with HBsAg positive expression were HBV+CCL4 group. The control group was injected intraperitoneally by 0.5 mL/kg olive oil and taken specimens at 0, 24, 48, 72 h. 8 mice in two model groups were taken as control and given 0.5 mL/kg intraperitoneal injection of olive oil solution, killed at 0 h. The other 24 mice were grouped randomly and given 0.5 mL/kg 10% CCL4 olive oil solution once to produce acute liver injury model, 8 mice among which were randomly selected for specimens at 24, 48, 72 h to detect whole blood leukocyte count (WBC), red blood cell (RBC), platelets (PLT), measured in serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (ALB). ResultsCompared with the control group, AST and ALT in CCL4 group peaked at 24 h, with significant difference (P<0.01)； compared with the CCL4 group, AST and ALT in HBV+CCL4 group peaked at 24 h, with a significant difference (P<0.01)；WBC decreased in model groups, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group; RB C in HBV+CCL4 group decreased at 24, 48, 72 h, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group，PLT decreased at 48， 72 h, with a significant difference (P<0.05). At 24 h AST and ALT peaked; WBC, RBC, PLT decreased in HBV transgenic mice induced by CCL4; ALP, TP, ALB had no significant difference. All the changes were in accordance with the standard indicators of acute liver injury. Conclu-sion58The establishment of acute liver injury model in HBV transgenic mice was of feasibility and reliability for further research on pathogenesis of acute liver injury.

Key words: HBV transgenic mice; carbon tetrachloride; acute liver injury

乙型肝炎病毒(HBV)的持续存在一直严重影响着人类的肝脏功能，目前全球约有4亿人是HBV携带者，全世界每年因HBV感染及其后遗症而死亡的人数为100万～200万[1]。急性肝损伤又是各种严重肝病发生、发展的始动环节，如果不能得到及时有效的治疗，很快就可转变为慢性肝损伤，甚至是肝纤维化、肝硬化乃至肝癌。因此，肝损伤已经成为严重危害人类健康的重大疾病之一。已有研究对转基因HBV小鼠基础的生理生化指标进行分析[2-4],采用四氯化碳(CCL4)制作急性肝损伤是经典的肝损伤模型[5-6]，转氨酶常作为衡量肝损伤的常用指标[7-9]。本研究选择携带HBV病毒的转基因小鼠作为工具鼠，利用CCL4诱导小鼠制作急性肝损伤模型，以观察在不同时间肝脏损伤的生物学特性的改变。

1材料和方法

1.1动物及分组选取32只健康雄性C57BL/6小鼠作为空白对照组，32只健康雄性C57BL/6小鼠作为CCL4干预组(购自新疆医科大学实验动物中心)；另购遗传背景相同的SPF级乙肝表面抗原(HBsAg)阳性转基因雄性小鼠32只作为HBV+CCL4干预组(购自上海南方模式生物公司)。均为6～8 周龄,动物适应性喂养1 w。

1.2试剂及仪器HBsAg 检测试剂盒(荷兰 Akio nobel 公司),天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)血清及血常规检测试剂(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，AST试剂盒(批号:140213008)，ALT试剂盒(批号:140113006)，ALP试剂盒(批号:140312006)，TP试剂盒(批号:140813009)，ALB试剂盒(批号:140913009),V-53LEO(Ⅰ)溶血剂(批号：2013041401),V-53LEO(Ⅱ)溶血剂(批号：20111011),V-53LH溶血剂(批号：2013070701),V-53清洁液(批号：20120428001),四氯化碳(天津永晟精细化工有限公司，批号20121025)，橄榄油(意大利AGIA，批号4406049)。生化仪(BS-120)、五分类血球仪(BC-5300Vet)购自深圳迈瑞有限公司，显微镜(LM3000)购自美国Leica公司。

1.3方法

1.3.1急性肝损伤模型的制作选取32只健康雄性C57BL/6小鼠作为空白对照组，实验组：选用32只健康雄性C57BL/6小鼠作为CCL4干预组，32只雄性HBsAg表达阳性C57BL/6-HBV转基因小鼠为HBV+CCL4干预组，制作急性肝损伤模型。空白对照组按0.5 mL/kg腹腔注射橄榄油溶液，于0、24、48、72 h 4个时间点取标本。实验组每组各留8只作为空白对照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄榄油溶液，0 h处死，其余24只各自随机分组，一次性给予0.5 mL/kg腹腔注射 10%CCL4橄榄油溶液，分别于24、48、72 h每组随机挑选8只小鼠，内眦静脉取血，3 000 r/min离心5 min，取血清测定AST、ALT、ALP、TP、ALB，全血用于测定血常规。

1.3.2血液学检查全血用EDTA-2K抗凝,混匀后用全血细胞计数仪测定白细胞(WBC)、红细胞(RBC)及血小板(PLT)。采用生化分析仪测定血清中AST、ALT、ALP、TP、ALB。

2结果

2.1肝损伤不同时期血清生化水平的改变

2.1.1肝损伤不同时期AST、ALT的变化组间比较，在24 h时， CCL4干预组AST、ALT明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；在48、72 h时，HBV+CCL4干预组AST、ALT明显高于 CCL4干预组，差异有统计学意义(P<0.05)。组内比较，空白对照组4个时间点的AST、ALT水平差异均无统计学意义。 CCL4干预组CCL4诱导24 h 时AST、ALT水平迅速升高，与0、48、72 h比较差异均有统计学意义(P<0.01)。HBV+CCL4干预组24 h AST、ALT水平迅速升高并达峰值，48 h水平仍较高，与0、72 h比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.1.2肝损伤不同时期ALP、TP、ALB的变化3组动物ALP、TP、ALB在经CCL4干预后无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2肝损伤不同时期血常规指标WBC、RBC、PLT的改变

2.2.1肝损伤不同时期WBC的变化组间比较，24 h时CCL4干预组WBC明显低于空白对照组和HBV+CCL4干预组，差异有统计学意义(P<0.05)。组内比较，空白对照组内各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)；24 h时CCL4干预组WBC明显低于0、48、72 h时，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.2.2肝损伤不同时期RBC的变化组内比较，HBV+CCL4干预组24 h时RBC明显低于0 h，差异有统计学意义(P< 0.05)，RBC在不同时间点3组间差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.2.3肝损伤不同时期PLT的变化组间比较，24 h时HBV+CCL4干预组PLT明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 组内比较，HBV+CCL4干预组，24 h PLT明显高于48、72 h，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1　3组动物AST、ALT、ALP的比较( ±s， U/L)

注：与空白对照组比较， *P<0.05； 与CCL 4干预组比较， △P<0.05； 与本组24 h比较， ★P<0.05。

注：与空白对照组比较，*P<0.05； 与CCL4干预组比较，△P<0.05； 与本组24 h比较，★P<0.05。

3讨论

正常情况下，大多数免疫功能正常的成人急性感染 HBV后可通过适应性免疫和固有免疫应答的协调作用而得以清除，并获得对 HBV再次感染的抵抗力，但约10%的成人HBV感染者或经母婴垂直传播途径感染的人群不能有效清除病毒，导致HBV持续感染，甚至最终发展成为肝硬化或肝癌[10]。CCL4是一种典型的肝脏毒性物质，其诱导的肝损伤模型有典型的组织学、生物化学和分子学的改变[11]，CCL4致急性肝损伤模型是经典模型之一。

诸兴桂[12]研究显示，转氨酶是作为鉴定肝脏是否损伤的标志物，其为可溶性酶。当肝细胞受到损伤时，这些酶就迅速释放，随之血清中转氨酶水平升高[13]。本研究结果显示，AST在干预24 h迅速达到峰值，且转基因HBV小鼠组最高，提示24 h时CCL4已经造成了肝脏功能障碍；而CCL4干预组在48 h就急剧下降，而转基因HBV小鼠从48 h开始下降至72 h仍远高出正常水平，可能提示与小鼠携带的HBsAg有关，可以推断健康小鼠因为肝功能健全，肝脏的自我修复能力很强，在48 h AST水平就降到一个低值，而转基因小鼠AST水平始终较高，提示肝损伤仍在进行中。ALT是反映肝损伤的很灵敏的指标。本研究结果显示，经干预24 h健康C57BL/6小鼠与未干预组小鼠相比ALT显著升高，提示24 h时CCL4已经造成了肝脏损伤；在48 h，经CCL4干预后的健康C57BL/6小鼠组ALT迅速下降，而转基因小鼠组仍处于较高水平，而且急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相平行，提示肝损伤在48 h较为严重。ALP、TP、ALB在CCL4干预后未见明显改变，可能是由于在早期肝损伤时ALP及蛋白水平尚未发生变化。本研究显示，转基因HBV小鼠WBC在0 h高于空白对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)，经CCL4干预24 h 后3组动物WBC均降低，这完全符合动物的临床表现，其中以CCL4干预组降幅最大，而转基因HBV小鼠次之，这可能是由于转基因HBV小鼠本身携带HBsAg以致其产生免疫耐受，反而对外来刺激反应较缓慢。转基因HBV小鼠经CCL4干预后，24 h RBC开始降低并低于正常值下限，48 h升高，这与WBC的变化保持一致，符合动物的临床表现。同样转基因HBV小鼠组经CCL4干预后，24 h PLT急剧下降并低于正常值下限，这也是符合急性肝损伤的临床血液学改变。

总之，本研究结果表明，在CCL4干预后HBV转基因小鼠24 h即可成功复制急性肝损伤模型，但与健康C57BL/6小鼠在CCL4干预后相比较，48 h健康小鼠转氨酶即可迅速降低，而HBV转基因小鼠则变化不大，这可能与HBsAg携带有关，导致HBV转基因小鼠肝脏自我修复能力较差。其具体机制需要进一步实验从病理学、分子生物学及免疫学等方面展开进一步研究。

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(本文编辑杨晨晨)