高血压肝火亢盛证动物模型生物学基础研究

高血压肝火亢盛证动物模型生物学基础研究

刘杨

(山东中医药大学附属医院心内科，济南 250014)

摘要：目的研究高血压肝火亢盛证动物模型的生物学基础。方法Wistar和自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)各20只，分别设为Wistar组和SHR组,观察2组大鼠的宏观表征、行为学及血压变化，用免疫组化法及Elisa测定大鼠脑内及血清中的NE含量。根据大鼠临床证候诊断标准对动物表征的证候属性进行判断。结果2组大鼠收缩压均会随着周龄增加而增加，SHR大鼠在各周龄明显高于Wistar大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；SHR大鼠随着周龄增加其易激怒的评分会逐渐增加，旋转耐受时间会随着周龄的增加而减少，而Wistar大鼠评分波动幅度及旋转耐受时间波动幅度不明显，2组大鼠不同时间易激怒评分差异和旋转耐受时间差异有统计学意义(P<0.05)；随着周龄的增加，2组大鼠5-HT在逐渐减小，NE在逐渐增加，SHR变化幅度明显大于Wistar，2组差异有统计学意义(P<0.05)。结论SRH大鼠在14～18周龄为肝火亢盛证的稳定期，和大鼠血液和脑内NE的含量有很大关系，可作为SHR肝火亢盛证的客观指标。

关键词：肝火亢盛证；自发性高血压大鼠；生物学基础

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.024

中图分类号：R259文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)10-1049-04

基金项目:山东省科技发展计划项目(2014GSF119011);山东省中医药科技发展计划(2013ZDZK-018);山东省中医药科技发展计划(2011-083)。

作者简介:刘杨(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事中医治疗心血管疾病疗效评价的研究。

收稿日期:(责任编辑:赵玉芝2015-07-07)

Biological base of anger hyperactivity hypertension animal model

LIU Yang

(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,

Ji’nan 250014,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological basis of hyperactivity hypertension anger animal model.MethodsDynamic acquisition of Wistar and spontaneously hypertensive rats (spontaneously hypertensive rats,SHR),each with 20,were set Wistar group and SHR group,observed macroscopic characterization,behavior and changes in blood pressure of two groups rats,determinate NE content in brain and rat serum by immunohistochemistry Elisa.Judgment of animal attributes characterizing based on clinical symptoms in rats standards.ResultsThe two groups SBP increases with weeks,SHR rats was significantly higher than in the week-old Wistar rats,the difference was statistically significant (P<0.05);SHR rats with weeks increase irritability ratings will gradually increase,the rotation time will increase tolerance and reduce weeks of age,and Wistar rats rates fluctuations and volatility is not obvious rotation endurance time,two groups of rats at different times irritability rating differences and rotation endurance time was significantly (P<0.05);With the increase of weeks old,5-HT in the two groups were gradually reduced,NE gradually increased,SHR change was greater than that Wistar,groups the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionSRH rats 14-18 weeks of anger hyperactivity stabilization period,and the content of the NE of blood and brain in rats have a great relationship,as an objective indicator of SHR anger hyperactivity.

Keywords:anger hyperactivity;spontaneously hypertensive rats;biological basis

原发性高血压会引起机体心脑血管等形成器质性的损害，导致脑卒中、心肾衰竭、冠心病等的出现，在临床上有高致残率和高致死率的特点。根据人类疾病来建立动物模型可有效的阐述疾病发病机理，并对人类疾病进行有效的预防和诊断，对治疗方法的研究有很大的应用价值，结合病症和动物模型可为中医基础和临床提供良好的桥梁作用，其稳定情况是进行中医研究重要的前提条件[1-2]。自发性高血压大鼠(SHR)动物模型和人类的原发性高血压有被国际公认的极相似的发病机制。有研究结果显示[3]，SHR体征、症状、器官及组织学病理和生化指标等都会随着大鼠周龄的增加而发生相应的变化，然而目前关于自发性高血压的中医证候时间属性的研究还有待完善。有课题研究显示[4],将临床病症和模型相结合，以临床疾病模型为基础，可以取得良好的稳定性和可靠性,在SHR模型中加入时间观理念，对模型证候出现的具体时间有很好的把控，可体现中医证动态性和阶段性。此次研究通过观察不同周龄SHR及Wistar的微观指标、宏观表征、行为学以及血液大脑中的NE含量变化,进而探讨SHR的稳定证候时间，以及和微观指标的关联，最终为临床自发性高血压诊断治疗提供依据。

1材料和方法

1.1一般资料选择20只SHR，均为8周龄大小，雄性，20只SHR血压均在150～172 mmHg之间;另选京都种的Wistar大鼠20只均为8周龄大小，雄性，每只血压均在95～115 mmHg之间，属于清洁级(购自深圳卫华实验动物技术有限公司；许可证编号：SCXK(深)2008～2011)。大鼠均进行常规喂养，室内空气过滤，正压通气，人工光照明暗各12 h(7 am～7 pm)，恒温(23±2) ℃，恒湿(50%±10%)。所有实验动物研究全部符合国家《实验动物管理条例》和《山东省实施〈实验动物管理条例〉办法》。第1周时间为适应性观察,主要通过血压测量、宏观表征采集以及行为学的实验训练来选择并筛除差异比较大的个体。

1.2方法主要仪器：采用日本BP-A无创测压仪对大鼠尾动脉进行测量，深圳D-SB平衡旋转仪测量大鼠对旋转的耐受时间，NE则采用Elisa试剂盒进行测量，产自上海;一抗是小鼠抗大鼠的NE单克隆抗体，上海华天制药有限公司提供；二抗是通用型，上海基因科技有限公司研制生产。

采用日本BP-A无创尾动脉测压仪对处于安静状态下的大鼠进行血压的测量。测量前连接好仪器，热泵处于开启状态，热泵温度最好控制在36～36.5 ℃，并用固定器将大鼠固定在仪器中，预热时间为10 min，过程严格按照测量仪使用说明书进行严格的规范操作，以保证取得更加正确的安静状态下的尾压，进行3次连续测量,最后取其平均值，在正式的血压测量前，每天应进行血压测试的训练，1次/d，连续进行7 d测量。

对大鼠的宏观表征进行动态采集，主要包括大鼠的活动度、精神状态、抓取的反抗性等一般状态，舌苔颜色、光泽度，爪、耳朵血管的充盈程度，毛色、光泽度，大小便的质地、颜色和排便时间等。此外，对大鼠的易激怒情况进行分级和评分，观察不同时间段大鼠的情绪变化。

将D-SB平衡旋转仪改进后，对大鼠的平衡耐受时间进行测量，把大鼠安置在转速为60 r/min的旋转平台之上，观察大鼠自旋转到跌落平台的时间并进行记录，2 min后，若大鼠仍然在平台上，就停止测试,所有大鼠的测试时间统一规定在上午8点-10点。于第8周龄、10周龄、14周龄及18周龄对大鼠血清中的NE进行Elisa测量。采用免疫组织的化学法进行大鼠脑组织NE的测量，备用石蜡的切片要进行预热和脱蜡水化，使用二步法对大鼠脑部NE进行检测：预热后进行脱蜡，酒精的梯度脱水，6 min微波修复，切片冷却后，用0.3%的H2O2进行15 min孵育，5 min PBS冲洗需进行3次，加入NE一抗，孵育温度为4 ℃，连夜孵育；加入辣根过氧化物酶标记过的二抗，30～40 min孵育，温度恒温下37 ℃，DAB进行显色，复染使用苏木素，随后进行脱水和透明,中性的树胶封片。采用PBS对阴性对照代替一抗来进行孵育，剩余步骤同前。在第12周龄、18周龄取大鼠血液5 mL，放置在真空采血管中，1～2 h温室放置，4 ℃下15 min的离心作业，3 000 r/min。

1.3观察指标观察不同时间大鼠的收缩压，根据易激怒分级对大鼠易激怒症状进行评分，观察大鼠掉落平台时间来判断大鼠的旋转耐受时间。参照文献对大鼠的易激怒分级和评分进行观察[5]：Ⅰ级：捉持大鼠颈部时，大鼠有惊跳、尖叫和躲避的现象，记1分；Ⅱ级：捉持大鼠颈部时，大鼠有咬人现象，记2分；Ⅲ级:提尾时，大鼠有尖叫和惊跳现象，且咬人，同笼打闹现象严重，记3分；没有上述情况的大鼠为无情况者，记0分。

2结果

2.1大鼠在不同时间的收缩压比较2组大鼠收缩压均会随着周龄增加而增加，但是SHR大鼠在各周龄的收缩压均明显高于Wistar大鼠，2组大鼠在不同周龄收缩压比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

mmHg

2.2大鼠在不同时间的易激怒程度评分SHR大鼠随着周龄增加其易激怒的评分会逐渐增加，而Wistar大鼠评分波动幅度不明显,2组大鼠在不同时间易激怒评分比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

分

2.3大鼠在不同时间的旋转耐受时间SHR大鼠的旋转耐受时间会随着周龄的增加而减少,而Wistar大鼠的旋转耐受时间波动幅度不明显,2组大鼠不同周龄的旋转耐受时间差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

s

2.4大鼠在不同时间血清5-HT、NE比较较12周龄而言,2组大鼠在18周龄的5-HT均有所减小，NE均有所增加，2组大鼠5-HT、NE差异有统计学意义(P<0.05)；且随着周龄的增加，2组大鼠5-HT在逐渐减小，SHR减小更加明显,SHR前后差异有统计学意义(P<0.05)；而2组NE在逐渐增加，2组前后NE差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

3讨论

人类疾病的动物模型建立能明确的阐述发病机理，对疾病的预防、诊断及治疗有非常重要的使用价值，将病症和动物模型相结合是医学研究的一个重要项目，如何制定可靠稳定的病症动物模型结合是中医

表4　大鼠在不同时间血清5-HT、NE比较 　μg/L

研究中重要的一步[6]。辨证论证被认为是中医治疗中的一个基本原则，将病症相结合又是辨证施治当中的关键，所以动物模型和病症的结合就自然而然的成为了临床和中医基础研究之间的重要桥梁。较理想的病症和动物模型的结合应该具备以下几个特点：1)和人类疾病有相应的类似点，对人类疾病变化有再体现作用；2)对人类疾病及某种代谢、机能和组织结构的变化有较可靠和特异性的反应；3)同时该模型应该有人类疾病临床的主要症状，并且能够经得起一系列的检验和证实。原发性高血压可引起人类心、脑、肾等器官的损害，导致冠心病、脑卒中和心、肾衰竭等疾病的发生，在临床上有高致残率、高死亡率的特点，对人类生活健康带来了很大的威胁[7-8]。

西医临床认为，高血压的发病机制中大鼠的交感神经系统有很强的活性、水钠储留以及大鼠血管内皮功能的障碍等特点。有研究显示[9-10]，随着大鼠周龄的增加,血压会出现相应的改变，SHR大鼠在8～18周龄期间，其血压会持续上升，在我们研究中也有同样的现象，SHR的血压从8周龄时的(165.22±8.73) mmHg上升到18周龄的(192.35±10.47) mmHg，变化非常明显，而Wistar大鼠的血压没有大幅度的波动现象。随着大鼠周龄的增加，其宏观表征及行为会出现明显的变化，而这些变化和NE含量的变化存在明显的关系，宏观表征中相对应的临床症状的易激怒评分在第18周龄时达到了(2.89±0.79)分，明显高于Wistar大鼠(0.26±0.02)分的易激怒评分，而相对应SHR的NE高达(42.94±5.04) μg/L，Wistar大鼠NE仅为(21.36±9.25) μg/L。此外，SHR临床表现目赤、面赤、口干舌燥、耳爪部的血管数量在增加，充盈度也在持续增长，这些和随着大鼠周龄增加而增加的NE有明显的关系。有研究显示[11-12]，脑内NE保持动态的平衡和情绪变化之间有密切的关系，脑中NE增加会造成痛阈下降引起头痛,相继的出现躁狂、烦躁易怒、有攻击意向等。SHR的NE明显高于Wistar大鼠可能是因为肝火亢盛所导致的烦躁、易怒、头痛等症状的重要机制。因此，血压、大脑中NE升高可能是引发高血压肝火亢盛证的重要生物学基础，在今后临床研究中应互相映证，为临床上高血压肝火亢盛寻找更加准确可靠的依据。

总之，高血压肝火亢盛的发病机理和发展进程和血管中活性物质NE有很大关系，建立动物模型为进一步观察证候生物学基础提供良好的依据。

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