一种高效率筛选抗菌中药的微量点菌药敏实验新方法

■邹文政 李忠琴 赖晓健 林 茂 江兴龙

（集美大学水产学院鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）

细菌性传染病是水产养殖动物的主要疾病之一，对水产养殖的危害最严重，常导致养殖鱼类的大量死亡，造成巨额经济损失。致病菌对抗菌药物的耐药性程度和频率越来越高，筛选高效的抗菌药物仍然是治疗细菌性传染病的最主要方法。在测试致病性细菌对某一药物的敏感性时，常用的方法有滤纸片法、牛津杯法、试管二倍稀释法、平板二倍稀释法。目前，这四种检测方法存在操作繁琐、工作量大、周期长、培养条件不一致等问题，不能快速地确定致病菌株对各药物的敏感性。尤其在初步筛选抗菌中药时，植物药材种类繁多，每种药材预先要粗提其有效部位，并去除萃取溶剂，操作程序更复杂、耗时更长。

本研究目的是为了建立针对多株致病菌可同步进行初筛抗菌中药的一种快速简便的药敏实验方法。首先利用超微粉碎机将15种植物药材粉碎成微米级颗粒（5～10μm），可提高药材中抑菌成分的有效溶出；随后将超微药粉添加到M-H营养琼脂培养基内制成系列药物浓度的固体平板，再接种9株致病菌于同一琼脂平板上进行药敏实验，24 h培养后观察供试菌的菌落生长情况，以无菌落形成的最低浓度为该中药的最低抑菌浓度（MIC），该方法定名为超微药粉琼脂稀释法。

1 材料和方法

1.1 药材与试剂

五倍子（Galla Chinensis，缩写GC，产地湖北）；石榴皮（Pomegranate Rind，缩写PR，产地安徽）；大黄（RhubarbOfficinale，缩写 RO，产地甘肃）；黄芩（Baical Skullcap Root，缩写BSR，产地河北）；虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati，缩写RPC，产地福建）；黄连（Golden Thread，缩写GT，产地四川）；连翘（Weeping Forsythia Capsule，缩写WFC，产地江西）；知母（Common Anemarrhena Rhizome，缩写CAR，产地河北）；首乌藤（Caulis Polygoni Multiflori，缩写CPM，产地江苏）；地榆（Radix Sanguisorbae，缩写RS，产地福建）；贯众（Dryopteris Setosa，缩写DS，产地四川）；金银花（Flos Lonicerae，缩写FL，产地辽宁）；紫花地丁（Purpleflower Violet，缩写PV，产地河南）；马齿苋（Portulaca Oleracea Linn，缩写POL，产地福建）；苦楝皮（Cortex Meliae，缩写CM，产地四川），均购自国药控股福建有限公司；标准肉汤培养基（Mueller-Hinton Broth，M-H），购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 菌株

9株鱼类致病菌均为本研究室从漳浦、莆田、龙岩、福清等养殖场病鳗中分离得到，并经人工感染实验证实为致病菌，同时菌株进行生理生化和基因鉴定，分别确定为气单胞菌属（Aeromonas sp.）B01、B19、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）B14、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B10、B15、B18、B20、B27、肠棕气单胞菌（Aeromonas enteropelgenes）B09。

1.3 菌悬液制备

从保种斜面上挑取菌苔划线接种M-H琼脂（Mueller-Hinton Agar）平板，置于28 ℃恒温培养箱内培养20 h；挑取单个菌落划线至新鲜斜面上，28℃培养24 h后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来，采用酶标仪测定菌液浓度，测定波长为600 nm。采用菌落计数法确定细菌密度与吸光度OD600的关系数，不同菌株的菌液OD600值约为0.2～0.3时，对应活菌计数值约为108CFU/ml，将菌液浓度稀释10倍调至107CFU/ml，即可作为药敏实验接种的菌悬液。

1.4 中药高压水提液的制备

称取50 g的中药超微粉，加蒸馏水300 ml置于20 kHz超声处理40 min后，置于高压灭菌锅中煎煮（110 ℃、10 min，95 ℃、30 min）提取，然后用50 ml离心管分装，用冷冻离心机8 000 r/min离心10 min，取上清液，放置4℃冰箱保存备用。

1.5 超微药粉或药液琼脂稀释药物敏感实验

在M-H培养基添加超微粉碎的中药粉末或者高压水提的药液，以浓度6 g/ml和1 g/ml开始进行二倍稀释，配置不同浓度梯度的药敏培养基。取9种已稀释好的107CFU/ml菌液各2μl点种在经过121℃、20 min灭菌后的同一个药敏培养基平板上，每个药物浓度梯度做3组平行。将接种好的平板放置28℃培养，24 h后观察供试菌的菌落生长情况，以无菌落形成的最低浓度为中药的最低抑菌浓度（MIC）。

1.6 纸片法的药物敏感实验

首先用无菌蒸馏水将高压水提的药液进行二倍稀释，配置不同浓度梯度的实验药液；用打孔器将滤纸打成直径为6 mm的圆纸片，经121℃高压灭菌30 min，将此无菌滤纸片分别浸入药液中，充分浸泡6 h后，用无菌镊子移至无菌试管中，再滴加50μl药液放在37℃干燥箱中烘干制成饱和的药敏纸片；取已配制成107CFU/ml的菌悬液100μl均匀涂布于90 mm琼脂平板上，将饱和的药敏纸片贴于琼脂平板表面，每皿贴5片不同浓度药敏纸片，于28℃恒温培养箱中培养24 h后，测量其抑菌圈直径。每个浓度的药物平行重复测试3次，判断致病菌对药物的敏感度。

2 结果

2.1 超微药粉琼脂稀释法测定中药对致病菌的抑制作用

选常用15种中药，采用本研究建立的超微药粉琼脂稀释法，检测9株不同种属的致病菌对它们的敏感度，从中筛选出抗菌活性高的药材，为今后进一步研制抗菌渔药提供参考（见表1）。从表1的实验结果可见，五倍子的抑菌效果最佳，其次是首乌藤、地榆，再次为石榴皮、贯众、大黄、黄芩、虎杖，其余中药的抑菌效果极差。B01、B27对五倍子极度敏感，其余7株菌为高度敏感；除B19、B20对首乌藤显示中度敏感外，其余7株菌均表现为高度敏感；B10对地榆显示低度敏感，B01、B14、B27为中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均为高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27对石榴皮显示中度敏感，仅B01、B09表现高度敏感，B10显示低度敏感，而B14显现不敏感；B20对贯众不敏感，B09、B27显示低度敏感，B10、B14、B15、B19显示对贯众中度敏感，B01、B18对贯众显示高度敏感；除B01、B10、B15对大黄中度敏感外，其余均为低度敏感；9株致病菌对黄芩均呈现低度敏感。9株致病菌对虎杖的敏感性差异很大，B01、B10、B14、B18表现为高度敏感，但除B01对苦楝皮和黄连均中度敏感外，其余菌株均不敏感。

表1 超微药粉琼脂稀释法测定各种中药的最低抑菌浓度（mg/l）

2.2 纸片法测定中药水提液对致病菌的抑菌圈大小

选取致病菌敏感性不同的3种中药（五倍子、地榆、石榴皮），按照中药高压水提液的制备方法制备药敏实验的药液，然后依据纸片法测定此3种药液对4株鳗鲡致病菌的抑菌圈大小，实验结果见表2。从表2中数据可知，不同浓度药液对4株鳗鲡致病菌的抑菌圈大小各不相同，随浓度的升高呈增大趋势。B01对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子125 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮 500 mg/l；B09 对 3 种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子500 mg/l、地榆500 mg/l、石榴皮500 mg/l；B14对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子250 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l；B15对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子250 mg/l、地榆250 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l。由此说明4株致病菌对五倍子均表现为高度敏感，B09、B15对地榆及B01、B09对石榴皮表现为高度敏感，B01、B14对地榆及B15对石榴皮显示为中度敏感，而B14对石榴皮表现为不敏感。

2.3 平板二倍稀释法测定中药水提液对致病菌的抑菌效果

表2 纸片法检测4株鳗鲡致病菌对3种中药水提液的敏感度（平均抑菌圈直径mm）

选取致病菌较敏感的8种中药（见表3），采用平板二倍稀释法进行药敏实验。从表3实验数据可知：平板二倍稀释法测定8种中药抑制9株致病菌的平均MIC值比超微药粉琼脂稀释法测定的结果均偏高，即灵敏度下降，但实验数据总体趋势相一致。

9株致病菌对五倍子仍然均呈现出高度敏感；对首乌藤除B19、B20为中度敏感外，其余7株菌均表现为高度敏感；对地榆高度敏感的菌株是B09、B15、B18、B20，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少一株B19，降为中度敏感；对石榴皮低敏感和不敏感的菌株是B10、B14、B15、B18、B20，比超微药粉琼脂稀释法测得结果多了三株（B15、B18、B20）；对贯众低敏感和不敏感的菌株是B09、B14、B15、B20、B27，比超微药粉琼脂稀释法测得结果多了二株（B14、B15）；对大黄中度敏感的菌株是B01、B15，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少了一株B10；对黄芩除了B01、B19表现低度敏感外，其余均为不敏感；对虎杖高度敏感的菌株是B01、B18，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少了二株（B10、B14），降为中度敏感。

3 讨论

本实验没有选择试管二倍稀释法测定致病菌对中药的敏感度，是因为中药粗提液含有大量色素，颜色深，且不同中药药液的颜色各不相同，会影响最终结果的观察判断，故在初期筛选抗菌中药的研究中不宜采用试管二倍稀释法。因此，我们选择药敏纸片法和平板二倍稀释法筛选抗菌中药，测定中药药液的抑菌效果，与本文建立的超微药粉琼脂稀释法进行比较，以确定该方法的可行性和可靠性。

表3 平板二倍稀释法测定各种中药水提液的最低抑菌浓度MIC（mg/l）

3.1 药敏纸片法与超微药粉琼脂稀释法的比较

针对9株致病菌从15种中药筛选出具有高效抑菌作用的药材。采用药敏纸片法一次试验需要制备81个琼脂平板；而采用超微药粉琼脂稀释法一次试验只需要45个琼脂平板。两者相比，筛选工作量显著减少，操作更快捷，实验材料费大大降低。

前期预实验结果显示，由于受纸片上药物含量的限制，低敏感度和不敏感的中药对致病菌均不产生抑菌圈，且考虑到实验操作量，故表2中只选择抑菌效果较好的3种中药（五倍子、地榆、石榴皮）和有代表性的4株致病菌进行比较实验。从表1和表2中的实验数据，采用超微药粉琼脂稀释法测得有效抑菌浓度低于纸片法，即灵敏度相应提高，然而4株致病菌对中药五倍子、地榆、石榴皮的分级敏感程度与纸片法检测结果一致。

3.2 平板二倍稀释法与超微药粉琼脂稀释法的比较

平板二倍稀释法与纸片法所使用的药物都是液体，在做药敏实验之前同样都要通过耗时较长、操作较复杂的中药提取工序。而超微药粉琼脂稀释法，只需将中药药材进行超微粉碎处理即可，步骤简单。由于药材粉碎颗粒足够细，达到了5～10μm，保证药材中的有效成分在琼脂培养基中可以充分溶出，无需再考虑有效成分提取率高低对药敏结果的负面影响。

比较表1和表3的实验数据，9株致病菌对8种不同中药的敏感度显示，超微药粉琼脂稀释法测得平均最低抑菌浓度均低于平板二倍稀释法，灵敏度明显增加。虽然这两种方法在抑菌浓度上测得数据有差异，个别菌株的敏感度级别发生变化，但不同中药对某一株致病菌的抑制效应强弱是一致的。

超微药粉琼脂稀释法测定的中药MIC值均低于平板二倍稀释法，原因在于平板二倍稀释法使用的是中药超微粉的高压水提液，而超微药粉琼脂稀释法是直接使用中药超微粉；采用水煎煮、高压抽提、超声提取、微波提取或有机溶剂萃取等中药粗提方法，均无法将中药植物药材细胞内的有效成分完全溶出，且提取过程也会造成有效成分的部分降解失活，故降低了抑菌效果；而本法将中药超微粉直接添加入琼脂培养基，在进行抑菌药敏实验过程中，微米级颗粒的药粉一直存在于细菌培养基内，不断释放抗菌有效成分，可达到较高的抑菌浓度。故可避免由于中药粗提方法选择不当，造成有效物质提取率低，而容易在初步筛选时将高效的抗菌药材遗漏等问题。

综上所述，本文建立的抗菌中药植物药材的初步筛选方法——超微药粉琼脂稀释法具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大（即每一个90 mm平皿可同时检测9～12株致病菌对药物的敏感度），实验成本低，以及药敏实验结果准确可靠等优点，是一种高效率的药敏实验方法，在实验研究中具有很好的应用价值，为开发和应用植物中药提供基础的参考数据。