混菌固态发酵豆渣条件优化及其发酵效果的初步研究

■张文佳 张永根 吴 爽 薛世崇

（东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨 150030）

豆渣营养成分丰富，研究表明，约有30%的大豆固形物、20%的大豆蛋白以及11%的大豆油脂在加工过程中残留在豆渣中。豆渣有相当高的利用价值，可用于作为优良的反刍动物饲料。但是由于本身存在含水量大，容易腐败变质，不容易储存和运输以及适口性差等缺点，导致不能够很好地被利用，使得本身含有的大量营养物质被浪费。

前人的研究大多围绕在通过利用豆渣的粗纤维作为微生物的碳源来生产菌体蛋白，从而使其成为优良的蛋白饲料。本实验通过微生物固态发酵的方法，选用两种菌株发酵豆渣，目的在于在保留豆渣原有的优质营养物质的基础上，粗蛋白含量有所提高，改善了其不良气味和适口性，并且最大程度的提高豆渣的贮存时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

原料：豆渣(来自于黑龙江省哈尔滨市某豆制品厂)。

辅料：麸皮(购于黑龙江省哈尔滨市东北农业大学附近某饲料市场)。

1.1.2 试验菌种

产朊假丝酵母（购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌种编号1769）经过两次活化；白地霉（中国工业微生物菌种保藏管理中心菌种编号1315）经过两次活化。

1.1.3 培养基

固体培养基：用含水量80%左右的湿豆渣和麸皮按一定比例混合含水量在60%左右的培养基；

产朊假丝酵母培养基：酵母膏0.3%、麦芽浸膏0.3%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1%，培养温度26℃；

白地霉培养基：5°Bé麦芽汁，pH值自然，培养温度28～30℃。

1.1.4 试验仪器

FOSS凯氏定氮仪、ANKOM A200i型半自动纤维分析仪,超净无菌操作台、pH计、隔水式恒温培养箱、ZD-85气浴恒温振荡器、高压灭菌锅、冰箱。

1.2 试验设计

1.2.1 发酵菌株比例的确定

试验设计两菌株5组不同混合比例，产朊假丝酵母与白地霉的比例分别为0∶100、25∶75、50∶50、75∶25、100∶0。在28 ℃、发酵72 h，每个处理3个重复。分别测定其在0、24、48 h和72 h的活菌数，来确定其添加的最佳比例。

1.2.2 最佳接种时间的确定

根据绘制的两种菌株的生长曲线，选择菌种最为活跃的对数期来接入培养基进行发酵。绘制生长曲线方法见1.3.4节。

1.2.3 最佳灭菌方式的确定

设计灭菌方式分别为：①不灭菌；②高压灭菌80℃、30 min；③高压灭菌100℃、5 min；④高压灭菌115℃、15 min。将扩大后的菌种以最佳混合比例10%的混合菌液添加比例接菌50 g发酵原料于250 ml锥形瓶中，于恒温气浴摇床以150 r/min、30℃培养48 h，通过测定其pH值来确定灭菌方式。

1.2.4 正交试验设计筛选最佳发酵条件组合

采用产朊假丝酵母（1769）和白地霉（1315）在上述试验中得到的最佳混合比例和接种时间接菌，最佳灭菌方式灭菌，同时发酵条件以A菌液添加量、B发酵原料含水量、C发酵温度、D发酵时间为试验因素，每个因素设定3个水平。以发酵产品的活菌数和pH值为评价指标，设计L9(34)正交试验，试验的因素水平见表1。

表1 正交试验的因素水平设计

1.2.5 最佳发酵条件下发酵产物的营养成分与原料的比较

通过单因素试验和正交试验得到的最佳发酵条件，在此条件下，得到的发酵产物与发酵原料进行比较，在物料质地、pH值、粗蛋白水平等方面比较发酵前后的变化。

1.3 试验方法

1.3.1 营养成分的测定方法

常规营养成分：方法详见《饲料分析及饲料质量检测技术》（杨胜，1993）；活菌数：平板计数法；可溶性碳水化合物：蒽酮比色法；pH值采用玻璃电极法。

1.3.2 菌株的扩大培养

产朊假丝酵母：将原种(冻干管)解冻至常温接种于培养基上，于恒温气浴振荡器150 r/min，28℃培养72 h。

白地霉：将原种（冻干管）解冻至常温接种于培养基上，于恒温气浴振荡器150 r/min，28℃培养72 h。

1.3.3 菌种间的兼容性试验

产朊假丝酵母培养基：分别培养单一产朊假丝酵母菌液和产朊假丝酵母白地霉混合菌液，每个处理3个平行，培养72 h，观察其生长情况并计数。

白地霉培养基：分别培养单一白地霉菌液和白地霉与产朊假丝酵母混合菌液，每个处理3个平行，培养72 h，观察其生长情况并计数。

1.3.4 两种菌株生长曲线的绘制

将已经活化的菌液继续扩大培养，从0 h开始，每2 h用10 ml离心管取样，用分光光度计于560 nm波长处测其吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制的曲线，即该菌株的生长曲线。以不接菌的培养基为空白调零，每个处理3个重复。

2 结果

2.1 发酵原料的营养成分测定

原料和发酵原料的常规营养成分如表2所示。

表2 原料和发酵原料的常规营养成分

2.2 菌种间的兼容性

①在相同的培养基上，分别培养单一产朊假丝酵母菌液和产朊假丝酵母白地霉混合菌液72 h，通过平板计数法观察其生长状况发现，与白地霉混合培养不影响产朊假丝酵母的生长。

②在相同的培养基上，分别培养单一白地霉菌液和白地霉产朊假丝酵母混合菌液72 h，通过平板计数法观察其生长状况发现，与产朊假丝酵母混合培养不影响白地霉的生长。

2.3 两种菌株生长曲线的绘制、最佳接种时间的确定

2.3.1 产朊假丝酵母的生长曲线

产朊假丝酵母的生长曲线见图1，由图1可以看出，在开始发酵到第8 h之前，微生物处于对数期，生长比较迅速，微生物活力最旺盛。而在8 h以后达到一个相对稳定的平台期。通过试验验证，在发酵后8 h之前，选择接种时间在二次活化后的第5 h，使其活力最旺盛，达到最好的发酵效果。

图1 产朊假丝酵母的生长曲线

2.3.2 白地霉的生长曲线

由白地霉的生长曲线图2可以看出，在0～16 h，微生物处在一个竞争期，生长情况不稳定。在16～40 h，微生物处于对数期，此时的活力最旺盛。而在40 h以后达到一个相对稳定的平台期。通过多次试验验证，在16～40 h这一范围内，选择接种时间应在二次活化后的第24 h，使其活力最旺盛，可以达到最好的发酵效果。

图2 白地霉的生长曲线

2.4 两种菌株添加的最适比例（见表3）

表3 两种菌株以不同比例发酵的活菌数[log(cfu/g)]随时间的变化

由表3可以看出，单一菌种发酵的效果没有混合发酵的活菌数量高，效果不如混合菌发酵的效果好，而从混菌发酵的三种不同比例发酵可以看出，在发酵24 h以后,混合比例为75∶25的发酵产物的活菌数明显高于其他两组，且差异显著(P＜0.05)，所以当白地霉与产朊假丝酵母的混合比例为75∶25时，发酵基质中活菌数最多，发酵效果最佳。

2.5 最佳灭菌方式的确定

固体发酵培养基发酵之前要对发酵基质进行灭菌处理，设计4个灭菌处理：A为不灭菌（生料）；B为80℃、30 min；C为100℃、5 min；D为115℃、15 min(高温灭菌)。通过对其发酵48 h的pH值和经济成本方面的因素综合衡量来确定最佳灭菌方式。这4种方式对发酵产物的pH值影响见图3。由图3可知，在不做灭菌处理的条件下，发酵底物的pH值在7左右，这种环境不适宜抑制杂菌生长，容易导致发酵失败，而其余三种灭菌方式，发酵底物的pH值均在5左右，适宜发酵并且能抑制其他不良杂菌生长繁殖，综合经济成本的因素衡量，选择C灭菌方式，即100℃下灭菌5 min即可。

图3 不同灭菌方式发酵48 h后的产物pH值

2.6 正交试验结果分析

以豆渣为原料，麸皮为辅料，选定两菌的接种比例为75∶25，并且选择了灭菌方式为100℃，灭菌时间为5 min，按照正交试验设计的因素水平试验，测定各因素水平下的活菌数值和pH值，并计算出不同处理标准水平之和k和极差值r，表4是正交试验的设计及结果，由试验结果比较其对活菌数和pH值两项指标的影响并结合其因素的影响主次程度，得到最佳的发酵条件为A3B3C2D3。即接菌量为15%，发酵原料含水量为70%，发酵温度为30℃，发酵时间为72 h。

2.7 发酵前后产物的部分营养参数的变化

在正交试验筛选出的发酵条件下，发酵产物较发酵原料的营养参数有了变化，营养参数以及发酵前后的变化情况见表5。通过试验得到的最佳发酵条件下进行产朊假丝酵母和白地霉混合固态发酵豆渣，产物在保留了原有的营养成分的基础上，粗蛋白提高了7～8个百分点，发酵产物由原来的豆腥味产生发酵香味，并且质地较原来更为疏松易散。产物的pH值明显降低，这种酸性环境下更有利于抑制杂菌的生长，提高了贮存时间。

表4 正交试验设计及结果

表5 发酵前后部分营养参数的比较

3 分析与讨论

3.1 菌种的生长情况及接种时间的确定

通过菌种间的兼容性试验已经证明，产朊假丝酵母和白地霉之间混合不影响彼此的生长状况，且两种菌株的最佳培养温度基本一致，通过比浊法绘制微生物的生长曲线是以不同时间菌液在560 nm处的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的。一般来说，微生物生长曲线分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物处在对数期时生长速度最快，代谢旺盛、酶系活跃、活菌数和总菌数大致一致，选择此时期将菌株接入培养基，能达到最优的发酵效果，通过曲线确定产朊假丝酵母对数期为开始发酵的8 h之前，而白地霉的对数期处于16～40 h。最后确定了两菌种的最佳接菌时间为产朊假丝酵母为二次活化后的第5 h，白地霉为第24 h。

3.2 最佳接菌比例的确定

在发酵过程中，由于两种菌株是互利共生的关系，混菌发酵效果明显高于单菌发酵效果，在灭菌良好的情况下，不同时间点取样测定其活菌数是衡量发酵效果好坏的重要指标，试验通过不同时间点的活菌数指标确定了最佳的发酵比例，即产朊假丝酵母和白地霉的混合比例为75∶25。

3.3 灭菌方式的确定

pH值是衡量发酵产物好坏的重要条件，不灭菌的处理，pH值比较高，这种接近中性的坏境，有害微生物不会受到抑制，导致发酵产物容易腐败变质。而其他三种灭菌方式48 h的pH值差异不显著，均处于pH值为5左右的酸性环境中，这种环境有利于抑制杂菌的生长，并且综合经济成本的因素考虑，选择灭菌方式为100℃，灭菌5 min即可。

3.4 正交试验因素水平的确定

3.4.1 接种量

接种量是影响发酵效果的重要因素指标，接种量主要通过影响微生物生长速度来影响生命周期，接种量过大或者过小，都会对发酵产生影响，接种量过大会由于微生物数量过多产生过多的代谢废物，而且会导致溶氧不足，因此要选择最合适的接种量是发酵的关键，由试验结果比较其对活菌数和pH值两项指标的影响，选取A3为该因素的最佳水平，即最适宜的接种量为15%。

3.4.2 发酵原料的含水量

水分是对固态发酵影响比较大的因素之一，水分含量较低时，对于发酵底物营养成分的溶解性能和底物颗粒的膨胀指数均较低，导致试验效果不理想，而水分如果过高，则会抑制氧气的流通和传递，致使微生物生长情况变差，发酵不理想，所以应对发酵基质的含水量进行最适宜的选择。由试验结果比较其对活菌数和pH值两项指标的影响，选取B3为该因素的最佳水平，即发酵原料含水量为70%。

3.4.3 发酵温度

由于每种微生物的最优培养温度都不一样，所以要严格控制温度，只有在最适宜的温度下，菌种才能达到最佳的生长状态，而且在发育旺盛的时期，还会产生热量，由试验结果比较其对活菌数和pH值两项指标的影响，选取C2为该因素的最佳水平，即发酵温度为30℃。

3.4.4 发酵时间

发酵时间作为一个重要的发酵指标对发酵结果的好坏有非常重要的影响，发酵时间与发酵选用的菌种培养时间关系密切，而由于两种菌株的交互作用有关，发酵时间过短，导致发酵不完全，营养物质没有被微生物最优的利用，而发酵时间过长，会使大量处于衰亡期的微生物代谢废物的堆积，随时间增加，菌体细胞增长缓慢，发酵后期培养基的营养不足导致菌体生长受到抑制。同时时间越长，发酵基质染菌的可能性就会增加。由试验结果比较其对活菌数和pH值两项指标的影响，选取D3为该因素的最佳水平，即最佳发酵时间为72 h。

3.5 发酵后部分营养参数的变化

通过试验得到的最佳发酵条件下进行产朊假丝酵母和白地霉混合固态发酵豆渣，产物在保留了原有的营养成分的基础上，粗蛋白提高了7～8个百分点，发酵产物由原来的豆腥味产生发酵香味，并且质地较原来更为疏松易散。产物的pH值明显降低，这种酸性环境下更有利于抑制杂菌的生长，贮存时间得到了提高。

4 结论

本试验采用产朊假丝酵母和白地霉混合固态发酵豆渣，对发酵菌种以及发酵方式进行了初步研究。并通过正交试验筛选出了最优的发酵条件组合为：接菌量为15%，发酵原料含水量为70%，发酵温度为30℃，发酵时间为72 h。在最佳条件下的固态发酵产物在保留了原料有益营养物质的基础上，使粗蛋白含量提高了7～8个百分点；改善了豆渣的气味和适口性；通过发酵降低了豆渣的pH值，从而延长了贮存时间。