鸡源产谷氨酸芽孢杆菌耐受稳定性研究

■王秋菊 王爽云 王秋云 马凤学 沈 丹 杨玉梅 龚 高 唐小彪

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.辽宁省阜新市育才中学，辽宁阜新 123000）

（参考文献15篇，刊略，需者可函索）

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

2014～2015年度，黑龙江八一农垦大学动物科技学院微生态实验室已知具有产生谷氨酸功能性的芽孢杆菌，优选其中5株芽孢杆菌为试验菌进行耐受稳定性研究。

1.1.2 培养基

营养肉汤LB培养液：根据说明书，按计量称取培养基，用蒸馏水加至500 ml。121℃高压灭菌20 min。

营养琼脂平板/斜面：根据说明书，按计量称取培养基和定量的琼脂，用蒸馏水加至500 ml。121℃高压灭菌20 min。

1.1.3 原种液的培养

①复苏：将芽孢杆菌斜面的菌全部溶于5 ml LB培养液中，37℃振荡培养24 h。

②原种液培养：将复苏的芽孢杆菌菌液，按4%(v/v)的接种量接至各自新鲜LB液体培养基中，37℃振荡180 r/min培养48 h。备用。

茶叶：茶叶样品于2017年10月21日采摘于漳州科技职业学院相同区域实训茶园，采摘量均为1 000 g，具体信息见表1。

1.1.4 活性菌液的制备

将筛选出芽孢杆菌原种液，按4%(v/v)的接种量，将200μl原种液分别接入5 ml新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养24 h，使其菌液浓度达到108cfu/ml，为第1代培养液；取200μl第1代培养液接入5 ml新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养24 h，为第2代培养液；以此类推，制备各芽孢杆菌第20代培养液。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢杆菌耐酸性的测定

将芽孢杆菌1代和20代发酵液200μl，按4%(v/v)的接种量，接入5 ml pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5、6.0的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养24 h，分别无菌取出培养菌液进行10倍比稀释，取10-4稀释梯度的稀释菌液100μl，于LB平板上，进行涂布，37℃培养24 h，菌落计数。以pH值为6.0培养液的菌落数作为对照，计算存活率。每个稀释梯度作3个重复，取平均数。

1.2.2 芽孢杆菌耐盐性的测定

将芽孢杆菌1代和20代发酵液200μl，按4%(v/v)的接种量，接入5 ml胆盐浓度分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养24 h，分别无菌取出培养菌液进行10倍比稀释，取10-4稀释梯度的稀释菌液100μl，于LB平板上，进行涂布，37℃培养24 h，菌落计数。以0%胆盐的培养液的菌落数作为对照，计算存活率。每个稀释梯度作3个重复，取平均数。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌耐酸性的测定

经耐酸性试验，5株第1代芽孢杆菌对pH值不同的生长环境表现出不同程度的耐受性。其中，J2在pH=4.5的环境下存活率高达131.01%，在其余pH值环境下存活率则在39%～47%之间；C34在pH=4.5的环境下存活率为62.50%，I3在pH=4.5的环境下存活率为63.01%，在其余pH值环境下存活率较低；有两株菌存活率均较低，这两株菌是J3和C5，其存活率在5%～28%之间。结果见表1。

表1 第1代芽孢杆菌耐酸性试验结果

经耐酸性检验，第20代芽孢杆菌对不同pH值生长环境表现出不同程度的耐受性。各株菌在pH=4.5环境下存活率均较高，分别为149.47%、103.33%、131.93%、122.63%和219.56%；其中J2在pH=1.5和pH=2.5的环境下存活率较高，分别为54.73%和54.34%，在pH=3.5和pH=4.5的环境下，与其他菌株相比存活率居中，略高于其余菌株。结果见表2。

表2 第20代芽孢杆菌耐酸性试验结果

2.2 芽孢杆菌耐胆盐性的测定

第1代芽孢杆菌在不同胆盐浓度的耐受结果见表3。在胆盐浓度为0.1%时各株菌的存活率变化率很大，从最低45.26%最高的112.37%之间。当胆盐浓度为0.2%时，基本各菌株的存活率均有所下降，平均为73.93%；在胆盐浓度0.3%时，存活率明显下降，平均为52.33%。其中J2的存活率均达到了90%以上，在胆盐浓度0.3%时存活率高达91.51%，最为稳定。

表3 第1代芽孢杆菌耐胆盐试验结果

不同浓度胆盐中第20代芽孢杆菌各菌株耐受结果见表4。5株菌株在不同浓度胆盐中也有不同程度的存活率，其中J2菌株在各浓度条件下都表现出较高的存活率，分别为98.73%、94.52%、92.25%，较为稳定，其他各菌株的耐受能力随胆盐浓度的升高而降低。

表4 第20代芽孢杆菌耐胆盐试验结果

3 讨论

随着畜牧业的发展和抗生素的广泛应用，抗生素的缺点逐渐暴露出来，如导致动物体内菌群失调、产生抗药性和畜产品适口性差等，尤其是食物链的药物残留问题引起了普遍关注。根据2012年美国《科学》杂志报道，中国年产抗生素达21万吨，2013年德国科学家发表了一份共同声明，其中提到限制抗生素在兽医兽药中的使用，在这种背景下寻找安全绿色的抗生素替代品成为当前研究的热点。而益生菌是目前被广泛运用于饲料工业中用来替代抗生素的一类物品。芽孢杆菌作为微生态制剂的一种重要来源细菌，在维护动物肠道健康、促进微生态平衡方面起着重要的作用，相对于其他益生菌而言，芽孢杆菌使用上具有更大的应用优势，成为目前研究的热点。芽孢杆菌的芽孢能够在体内迅速萌发增殖，从而起到改善肠道菌群、促进免疫、抗菌防病及相关的代谢酶活性等生理作用。而芽孢杆菌能在动物体内充分发挥益生作用的前提是可以有活性的、大量的通过家畜胃肠道并在动物体内大量增殖，而在家畜胃肠道中的胃酸和胆盐构成了一道天然的屏障，只有耐受稳定性高的芽孢杆菌才能承受这样的环境，才能发挥作用。所以，本实验就是测定所分离的芽孢杆菌是否具有较高的耐受稳定性。

饲料被动物采食后首先进入的是胃中，这是芽孢杆菌进入动物体内的第一道屏障。动物的胃中存在大量的酸性消化液，用来消化摄入的食物，在进食后胃液pH值一般为2.0～3.0。胃中的酸会水解细菌从而对其产生破坏作用，使其无法发挥作用或者生存。而芽孢杆菌必须通过胃中的高酸性胃液才能到达肠道发挥益生作用，因此必须具有良好的耐酸能力。本实验研究了5株芽孢杆菌在pH值为1.5～4.5的酸性溶液中的耐受性。

小肠是益生菌起作用的主要场所，在益生菌进入小肠后，动物肠道中含有一定浓度的胆盐，其含量是不断变化的，小肠内的胆盐的高渗透压环境不利于其存活，这是芽孢杆菌在动物胃肠道存活和增殖的另一屏障，动物肠道内的胆盐浓度在一般情况下为0.03%～0.30%，十二指肠中的胆汁酸盐对芽孢杆菌具有抑作用，芽孢杆菌要在肠道中存活、增殖就必须耐受0.3%胆盐环境，菌体只有具备较高的耐胆盐性，才能保证足够的活菌数，继而发挥其益生作用。本实验研究了5株芽孢杆菌在浓度为0.10%～0.30%的胆盐中的耐受性。

动物微生态制剂因其安全无毒副作用、效果好、无药残、很少产生耐药性、不污染环境而被广泛运用，而以芽孢杆菌为出发菌种的微生态制剂添加在动物饲料中饲喂后，能拮抗病原微生物，维持肠道的菌群平衡，增强机体免疫力，提高动物生产性能。芽孢杆菌微生态制剂在许多家畜饲料中均有应用，王海周在芽孢杆菌对蛋鸡益生作用研究中提出，芽孢杆菌能在一定程度上促进蛋鸡的生长，提高饲料转化率。李丽红的研究结果表明，芽孢杆菌能改善蛋鸡的生产性能，提高经济效益。利明在研究结果中表明，芽孢杆菌能提高肉仔鸡饲料能量表观代谢率及蛋白表观消化率，在一定程度上提高饲料利用率，降低排放，减少环境污染。而芽孢杆菌是否能产生这些有益作用的前提是其耐受稳定性的高低，所以，具有高生存力的芽孢杆菌才能更好地发挥其作用。

4 结论

经耐酸性试验，芽孢杆菌对不同pH值和胆盐浓度生产环境表现出不同程度的耐受性。其中，芽孢杆菌J2表现出最好的耐受性。第1代芽孢杆菌J2在pH=1.5的环境下存活率可达46.43%，第20代芽孢杆菌J2在pH=1.5的环境下存活率较高，为54.73%。在胆盐浓度0.3%时，第1代芽孢杆菌J2存活率高达91.51%，最为稳定。第20代芽孢杆菌在胆盐0.3%浓度下，存活率高达92.25%，较为稳定。故J2可作为芽孢杆菌制剂后备菌深入研究。