复杂生物样品中马来酸依那普利的快速分析新方法

复杂生物样品中马来酸依那普利的快速分析新方法

杨天鸣，黄国贞，付海燕，周蓉，李鹤东，姜杜

(中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074)

摘要：建立了复杂生物基质中马来酸依那普利的快速检测新方法。运用高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)检测技术结合自加权交替三线性分解(SWATLD)二阶校正算法直接快速测定血浆、唾液和尿液生物基质中马来酸依那普利的含量，获得血浆、唾液和尿液3种生物基质中马来酸依那普利的平均回收率分别为(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)% 和(100.8±3.4)%。通过分析品质因子，包括灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测限(LOD)、检测量(LOQ)和预测均方差(RMSEP)评估了该方法的性能，利用t-检验对结果进行了校验。结果表明，该方法具有的“二阶优势”可在不同生物基质样中内源化学物质干扰共存下，有效分辨和定量分析马来酸依那普利，结果准确可靠。

关键词：马来酸依那普利；HPLC-DAD；SWATLD；血浆；唾液；尿液

基金项目：国家“十二五”科技支撑计划资助项目(2012BAI27B00)，国家自然科学基金资助项目(21205145)，中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(CZZ10005，CZY12028，CZY13019)

收稿日期：2015-05-15

作者简介：杨天鸣(1962-)，男，湖北黄冈人，教授，主要从事药物分析、化学生物学方面的研究，E-mail：tm28y@aliyun．com；通讯作者：付海燕，副教授，E-mail：fuhaiyan@mail．scuec．edu．cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.017

中图分类号：O 657.72文献标识码：A

马来酸依那普利(enalapril maleate)是Ⅱ代长效血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，主要用于治疗原发性高血压,是一种前体药物[1]，水解后转化为活性药物，具有药理作用平稳、持续时间长、不良反应小、安全有效等特点[2-3]。

目前，马来酸依那普利的常用分析方法有酶动力学法[4]、RP-HPLC法[1]、GC-MS法[5]、LC-MS法和HPLC-UV法[3]等。由于马来酸依那普利的最大吸收波长为末端吸收，HPLC-UV法受结构相近的非待测药物和代谢产物、内源性杂质的干扰，在分析生物样品之前，通常要经过分离纯化等处理过程；GC-MS和LC-MS法的样品处理步骤繁琐，且成本较高，不适合快速分析。鉴于此，作者采用HPLC-DAD结合化学计量学自加权交替三线性分解(SWATLD)[6]二阶校正算法，在不需化学分离的情况下，实现了复杂生物基质中马来酸依那普利的快速准确定量分析。

1实验

1.1　算法理论简介

1.1.1SWATLD算法及原理

SWATLD算法沿用ATLD算法思路，通过交替最小化3个新的具有内在联系且与三线性模型相关的目标函数，来完成三维数据阵的分解。

SWATLD算法的目标函数为：

其中，diag(sqrt(1./diagm(ATA)))、diag(sqrt(1./diagm(BTB)))和diag(sqrt(1./diagm(CTC)))3个权重矩阵，以平衡每个目标函数中的2个部分。

SWATLD算法除具有其它算法的优点外，如对组分数不敏感、收敛速度较快(一般迭代100次以内就可以收敛)，因有求平均值的计算步骤还具有对噪声不太敏感的特征。与同类算法相比，SWATLD具有较好的分析性能。

1.1.2品质因子

本实验所考察的分析方法的品质因子包括灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测限(LOD)[7]、检测量(LOQ)[7]和预测均方差(RMSEP)，计算方程为：

SEN = λ﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(1)

SEL =﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(2)

LOD = 3.3s(0)

(3)

LOQ = 10s(0)

(4)

(5)

式中：下标nn表示矩阵[(ATA)·(BTB)]-1中的第(n，n)个元素；λ为单位浓度下组分n的总信号，也称为浓度得分参数；s(0)为采用二阶校正算法平行分析3个空白背景之后得到预测浓度的标准偏差；cact和cpred分别为第i个实验样品的真实浓度和预测浓度；I为预测样品的组分数。

1.2　材料、试剂与仪器

健康成年SD大鼠[SCXK(鄂)2008-0005]，购于湖北省实验动物研究中心。

马来酸依那普利标准品(批号：100705-200902)，中国药品生物制品检定所；磷酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，美国 Tedia 公司；肝素(150 U·mg-1,水分0.49%)；超纯水。

Ultimate 3000型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器，WPS-3000SL自动进样器，LPG-3400SD四元梯度泵，TCC-3000RS柱温箱，DIONEX Chromeleon色谱工作站),美国赛默飞-戴安有限公司；色谱柱：Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm),美国Thermo有限公司;Allegra 64R型台式高速冷冻离心机,美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3　方法

1.3.1色谱条件

流动相：65%甲醇-35%磷酸溶液(用磷酸调pH=3.5±0.1)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；检测器：DAD；检测波长：190～400 nm。

1.3.2标准溶液的配制

称取马来酸依那普利标准品0.0501 g于烧杯中，甲醇溶解后转移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，静置，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.3校正样和验证样的配制

用马来酸依那普利标准溶液分别配制浓度(μg·mL-1)为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的10个校正样和浓度(μg·mL-1)分别为30、40、50、60、70、80的6个不加任何干扰物质的验证样(T1～T6)。

1.3.4生物样品的制备

1.3.4.1生物样品的预处理

大鼠血浆生物样制备：取健康成年SD雄性大鼠6只，禁食(不禁饮水)12 h后，于大鼠眼眶静脉丛采血约0.5 mL转入1.5 mL离心管(用肝素润湿并挥发干)，在4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心5 min，用微量移液器吸取血浆，保存于-40 ℃冰箱，备用。

人唾液生物样制备：收集未服药的健康志愿者自然状态下分泌的唾液，在4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心5 min，用微量移液器吸取上层清液，备用。

人尿液生物样制备：收集未服药的健康男性志愿者晨尿，在4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心5 min，用微量移液器吸取上层清液，备用。

1.3.4.2供试品的配制

配制9个含100 μL血浆的马来酸依那普利浓度(μg·mL-1)分别为10、20、30、40、60、70、80、90、100的血浆基质样品(P1～P9)以及3个只含100 μL血浆的血浆空白样品；配制8个含500 μL唾液的马来酸依那普利浓度(μg·mL-1)分别为30、40、50、60、70、80、90、100的唾液基质样品(S1～S8)以及3个只含500 μL唾液的唾液空白样品；配制10个含 100 μL尿液的马来酸依那普利浓度(μg·mL-1)分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的尿液基质样品(U1～U10)以及3个只含100 μL尿液的尿液空白样品。

2结果与讨论

2.1　三维数据阵校正模型的构建和验证

采用HPLC-DAD检测仪器，获得物质190～400 nm的检测数据。已知马来酸依那普利是一个复盐，在HPLC检测时会出现2个色谱峰。从马来酸依那普利不同波长的高效液相色谱流出图(图1)中可以看到，在3.7 min有马来酸的峰，依那普利则在4.4 min左右出峰。

为了用于数据解析，截取3.5～5.0 min和210～220 nm的色谱数据，组成451×11×16(校正样+验证样)的三维数据阵模型。用SWATLD算法校正结果见表1。

图1　马来酸依那普利不同波长的高效液相色谱流出图 Fig.1　HPLC Chromatogram of enalapril maleate at different wavelengths

2.2　复杂生物基质样品中马来酸依那普利的SWATLD定量解析

表1马来酸依那普利验证样SWATLD算法校正分析结果

Tab.1Results of enalapril maleate validation samples
based on calibration of SWATLD algorithm

样品编号 加入马来酸依那普利浓度 μg·mL-1 回收率 %T130106.2T240107.9T35096.1T460103.2T570100.2T680100.7平均回收率/%102.4±4.3RMSEP/(μg·mL-1)4.90T(t-test)t50.05=2.011.34

2.2.1血浆基质样品中马来酸依那普利的解析

血浆基质样品的三维高效液相色谱如图2所示。

图2　血浆基质样品的三维高效液相色谱 Fig.2　Three-dimensional HPLC chromatogram of plasma matrix samples

由图2可见，血浆空白样品在实验所选区域内对马来酸依那普利的准确测定有一定的干扰。如果不对样品进行化学分离，进行常规色谱检测会造成困难，对分析结果有较大的影响。HPLC-DAD结合SWATLD算法能很好地解决这一问题，可以在空白干扰明显的情况下，不需对样品进行化学分离，直接实现对目标组分马来酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.2唾液基质样品中马来酸依那普利的解析

唾液基质样品的三维高效液相色谱如图3所示。

图3　唾液基质样品的三维高效液相色谱 Fig.3　 Three-dimensional HPLC chromatogram of saliva matrix samples

由图3可见，唾液空白样品在实验所选区域内对马来酸依那普利的准确测定有一定的干扰，如果不对样品进行化学分离，进行常规色谱检测会造成困难，对分析结果有较大的影响。HPLC-DAD结合SWATLD算法不需对样品进行化学分离，可直接实现对其中目标组分马来酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.3尿液基质样品中马来酸依那普利的解析

尿液基质样品的三维高效液相色谱如图4所示。

图4　尿液基质样品的三维高效液相色谱 Fig.4　Three-dimensional HPLC chromatogram of urine matrix samples

由图4可见，尿液空白样品在实验所选区域内对马来酸依那普利的准确测定有一定的干扰，如果不对样品进行化学分离，进行常规色谱检测会造成困难，对分析结果有较大的影响。HPLC-DAD结合SWATLD算法不需对样品进行化学分离，可直接实现对其中目标组分马来酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.4不同生物基质样品中马来酸依那普利的SWATLD定量解析结果

分别截取血浆基质样品、唾液基质样品、尿液基质样品3.5～5.0 min和210～220 nm的色谱数据与样本(校正样+预测样)，组成451×11×19、451×11×18、451×11×20的三维数据阵模型，用SWATLD多维数据解析方法进行定量解析，结果见表2。

表2不同生物基质样品中马来酸依那普利的SWATLD定量解析结果

Tab.2Results of enalapril maleate in different biological matrices samples based
on calibration of SWATLD algorithm

血浆生物基质样品样品编号预测值/(μg·mL-1)回收率/%唾液生物基质样品样品编号预测值/(μg·mL-1)回收率/%尿液生物基质样品样品编号预测值/(μg·mL-1)回收率/%P110.42104.2S128.4394.8U19.4094.0P220.28101.4S243.96109.9U219.8499.2P330.56100.6S346.6293.3U330.39101.3P439.5698.9S455.4192.4U442.27105.7P559.7799.6S563.9891.4U552.61105.2P665.8794.1S680.20100.3U662.41104.0P773.7492.2S789.6899.6U768.4497.8P888.0397.8S8103.09103.1U881.61102.0P993.5393.5U990.57100.6U1098.4398.4平均回收率/%98.0±3.798.1±6.0 100.8±3.4 RMSEP/(μg·mL-1)2.863.45 1.41 T(t-test)1.47

由表2可知，对血浆基质样品、唾液基质样品和尿液基质样品的平均回收率分别为(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)%和(100.8±3.4)%；RMSEP分别为2.86 μg·mL-1、3.45 μg·mL-1和1.41 μg·mL-1，并且在95%的置信水平下，不同生物基质样品的回收率和理想值100%所对应的t-检验结果没有显著性差异，说明SWATLD算法对于这3种生物基质样品的预测结果具有统计学意义。

2.2.5品质因子的考察

SWATLD算法预测3种不同生物基质样品中马来酸依那普利的含量，其品质因子(灵敏度SEN、选择性SEL、检测限LOD、检测量LOQ)考察结果见表3。

表3SWATLD算法品质因子考察结果

Tab.3Results of quality factors by SWATLD algorithm

样品SELSENμg·mL-1LODμg·mL-1LOQμg·mL-1血浆0.0020.032.597.84唾液0.182.700.270.81尿液0.010.230.742.24

由表3可知，SWATLD算法对3种不同生物基质样品中马来酸依那普利的预测性能良好，能在复杂生物基质样品中选择性准确检测目标组分。

3结论

运用高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)检测技术结合自加权交替三线性分解(SWATLD)二阶校正算法直接快速测定血浆、唾液和尿液生物基质样品中马来酸依那普利的含量，与普通色谱检测相比，无需进一步的提取分离以及优化色谱分离条件等步骤，通过与SWATLD二阶校正算法结合，利用该方法的“二阶优势”，克服了血浆、唾液和尿液体系中未知组分的干扰，通过“数学分离”代替或部分代替“化学分离”，从而简化了样品预处理以及分析检测的步骤，并减少有机溶剂的污染，同时也提高了分析效率，再次证明该方法的可行性及其在复杂生物样品分析方面的巨大优势，为临床实时快速准确定量分析体液中马来酸依那普利含量提供一种新型的方法。

参考文献：

[1]王宏良，费金钰，刘新义.RP-HPLC 法测定人血浆依那普利拉浓度及其药代动力学研究[J].实用临床医药杂志，2010，14(12)：88-89.

[2]苏锋.马来酸依那普利叶酸片治疗 H 型高血压的疗效观察[J].实用心脑肺血管病杂志，2013，21(11)：77-78.

[3]NAVEED S，SULTANA N，ARAYNE M S.HPLC-UV Method for the determination of enalapril in bulk，pharmaceutical formulations and serum[J].J Anal Bioanal Techniques，2012,3(1):1-4.

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A Method for Fast Determination of Enalapril Maleate

in Complex Biological Matrices

YANG Tian-ming,HUANG Guo-zhen,FU Hai-yan,ZHOU Rong,LI He-dong,JIANG Du

(CollegeofPharmacy,South-CentralUniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

Abstract：A method for fast determination of enalapril maleate in complex biological matrices was developed.The content of enalapril maleate in plasma，saliva and urine matrices were directly and rapidly determinated by HPLC-DAD combined with the second-order correction algorithm of SWATLD.The average recovery of enalapril maleate in three biological matrices of plasma，saliva and urine were (98.0±3.7)%，(98.1±6.0)% and (100.8±3.4)%,respectively.The performance of the method was evaluated by analyzing the quality factors，including sensitivity(SEN)，selectivity(SEL)，limit of detection(LOD),limit of quantitation(LOQ) and RMSEP.t-Test was used to check the results. This method had the “second-order advantage”.Enalapril maleate was distinguished efficiently and analyzed quantitatively in the presence of different biological matrixs with endogenous substances,and the analytical results were accurate and reliable.

Keywords：enalapril maleate；HPLC-DAD；SWATLD；plasma；saliva；urine