超声辅助提取对石榴籽提取物抗氧化活性的影响

超声辅助提取对石榴籽提取物抗氧化活性的影响

颜红梅，赵文英，张萍萍

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

摘要：研究提取方法对石榴籽提取物抗氧化活性的影响。以无水乙醇为溶剂，分别采用超声法、回流法、加压法、超声辅助回流法、超声辅助加压法以及超临界法提取石榴籽中抗氧化活性成分，并对其清除DPPH自由基的能力、清除羟基自由基的能力、还原能力、脂质过氧化的抑制能力进行检测。结果表明，超声辅助回流法和超声辅助加压法所得石榴籽提取物的抗氧化能力相对于其它方法均有明显提高，尤其对DPPH自由基的清除率分别高达92.1%和80.2%。超声辅助能显著提高石榴籽提取物的抗氧化活性。

关键词：石榴籽提取物；抗氧化能力；提取方法；超声辅助

收稿日期：2015-05-14

作者简介：颜红梅(1989-)，女，山东枣庄人，硕士研究生，研究方向：中药现代化，E-mail:626537341@qq.com；通讯作者：赵文英，副教授，E-mail：wyzhao0059@aliyun.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.011

中图分类号：R 284.2文献标识码：A

石榴籽是药食两用的石榴科植物石榴的种子，可抵抗人体炎症和氧自由基的破坏，具有延缓衰老、预防动脉粥样硬化、减缓癌变进程、防治乳腺癌、降低血糖、治疗腹泻等作用。这些生理药理活性均与其所含抗氧化成分(多酚类、不饱和脂肪酸类)相关[1-3]。有研究者对石榴籽提取物、石榴籽中多酚以及石榴籽油进行了提取及体外抗氧化作用研究[2，4-5]。

目前，人们对石榴籽的研究大都采用单一方法提取并考察提取物的抗氧化活性，而采用不同提取方法对石榴籽提取物抗氧化活性影响的研究报道较少[6-7]。苗利利等[8]研究了不同提取方法对石榴籽油中的有效成分(石榴酸)含量的影响，证明提取方法对石榴酸含量会产生影响，但不同提取方法对其抗氧化活性的影响尚未进行研究。为系统考察提取方法对石榴籽提取物抗氧化活性的影响，作者以无水乙醇为溶剂，分别采用超声法、回流法、加压法、超声辅助回流法、超声辅助加压法及超临界法等方法对石榴籽进行提取，并对提取物的体外抗氧化活性进行分析与比较，以期选出最适合提取石榴籽中抗氧化活性成分的有效方法。

1实验

1.1　材料、试剂与仪器

石榴籽，购于枣庄，干燥粉碎后过40目筛。

DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，美国Sigma公司；铁氰化钾，天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸、磷酸氢二钠，上海埃彼化学试剂有限公司；亚油酸，上海伊卡生物技术有限公司；2-硫代巴比妥酸，阿拉丁试剂有限公司；水杨酸，中国亨达精细化学品有限公司(上海)；磷酸二氢钠，天津广成化学试剂有限公司；无水乙醇；超纯水。其余试剂均为分析纯。

KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；T-6型新世纪紫外可见分光光度计，普析通用仪器有限责任公司；DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；加压提取器，自制；HA221-50-06型超临界萃取装置，江苏南通仪创实验仪器有限公司。

1.2　方法

1.2.1石榴籽提取物的制备

1)超声法

将石榴籽粉与无水乙醇(料液比1∶30，g∶mL，下同)在100 Hz频率下超声30 min，回收溶剂后得超声法下的石榴籽提取物。

2)回流法

将石榴籽粉与无水乙醇(料液比1∶30)于回流装置中加热回流2 h，回收溶剂后得回流法下的石榴籽提取物。

3)加压法

将石榴籽粉与无水乙醇(料液比1∶30)于自制加压提取器中在100 ℃、0.25 MPa条件下提取30 min，回收溶剂后得加压法下的石榴籽提取物。

4)超声辅助回流法

将石榴籽粉与无水乙醇(料液比1∶30)超声30 min后，将料液混合物按回流法提取1 h，得超声辅助回流法下的石榴籽提取物。

5)超声辅助加压法

将石榴籽粉与无水乙醇(料液比1∶30)超声30 min后，将料液混合物按加压法提取30 min，得超声辅助加压法下的石榴籽提取物。

6)超临界法

将石榴籽粉在CO2超临界流体萃取装置中以萃取压力20 MPa、分离压力5 MPa、提取釜温度40 ℃、无水乙醇作夹带剂的条件下萃取2 h，得超临界法下的石榴籽提取物。

1.2.2石榴籽提取物抗氧化活性的测定

1)DPPH自由基清除能力

分别精密称定10 mg各提取方法下得到的石榴籽提取物于100 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀备用。

将上述各溶液分别配制成不同浓度(0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)的溶液，按表1加样，总体积为4 mL，在室温下避光反应30 min后在517 nm处测定各样品溶液的吸光度(A)。每组样品溶液平行测定3次，取平均值[9]。

表1DPPH自由基清除实验加样表

Tab.1Sample table of DPPH radical scavenging test

加样溶液测定项目2.5mLDPPH溶液+1.5mL无水乙醇溶液A02.5mLDPPH溶液+1.5mL待测样品溶液Ai2.5mL无水乙醇溶液+1.5mL待测样品溶液Aj

DPPH自由基清除率(Y)按式(1)计算：

Y=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(1)

式中：A0为未加样品溶液时所测溶液吸光度；Ai为加入样品溶液后所测溶液吸光度；Aj为未加DPPH溶液的样品溶液吸光度。

2) 羟基自由基清除能力

采用Fenton分光光度法进行测定[10]。向试管中加入一系列不同提取方法下的不同浓度(0.2 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取液1.0 mL、FeSO4溶液 (1.8 mmol·L-1) 2.0 mL、水杨酸的乙醇溶液(1.8 mmol·L-1) 1.5 mL。空白以1.0 mL蒸馏水代替样品溶液，最后加入H2O2(0.03%)0.1 mL启动反应。振荡混匀，37 ℃水浴中反应30 min，在510 nm处测定吸光度(A)。

羟基自由基清除率(D)按式(2)计算：

D=[(A0-As)/A0]×100%

(2)

式中：A0为空白溶液的吸光度；As为加入样品溶液后的吸光度。

3)还原能力

采用K3[Fe(CN)6]还原法进行测定[11]。分别取不同提取方法下的不同浓度(0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取液1 mL于试管中，各加入PBS溶液(0.2 mol·L-1，pH值 6.6)2.5 mL和1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL,混合均匀，于50 ℃水浴中反应25 min。再分别加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合均匀。各取上清液2.5 mL，分别加入1.0 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL蒸馏水，混合均匀。以5.0 mL蒸馏水与1.0 mL 0.1%的FeCl3混合溶液作空白。10 min后于700 nm处测定吸光度(A)。

4)脂质过氧化的抑制作用

取2.5%的亚油酸乙醇溶液1 mL于带塞试管中，分别加入不同提取方法下的不同浓度(0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取物0.5 mL，加入25 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL， 以PBS溶液(0.1 mol·L-1，pH值 7.4 )补充至10 mL，于40 ℃恒温箱中避光培养24 h。取培养后样品溶液2 mL分别加入0.2 mL 20% 三氯乙酸溶液，静置10 min后，加入1%的硫代巴比妥酸溶液1 mL，混合均匀。加塞后置于沸水浴中反应15 min，于532 nm处测定吸光度(A)。对照管除不加样品溶液外其它均相同，空白管以PBS溶液代替样品溶液[12]。

脂质过氧化抑制率按式(3)计算：

脂质过氧化抑制率=[(A0-A)/A]×100%

(3)

式中：A0为对照管所测吸光度；A为加样品溶液后所测吸光度。

2结果与讨论

2.1　DPPH自由基清除率

不同提取方法下的石榴籽提取物对DPPH自由基的清除率如图 1所示。

图1　DPPH自由基清除能力的比较 Fig.1　Comparison of DPPH free radical scavenging capacity

由图1可知，除超临界法外，其余方法的石榴籽提取物的DPPH自由基清除率在实验浓度范围内均呈增长的趋势。并且超声辅助回流法与超声辅助加压法相对于单一的回流法与加压法下的DPPH自由基清除率均有显著的提高。

DPPH含有三个苯环,在517 nm处具有最大吸收，当有供氢能力的抗氧化剂(如酚类)存在时，可以通过吸光度的变化来检测试样的抗氧化能力[13]。在超临界法中，CO2为非极性溶剂，极性相对较弱的脂质类物质易被溶解提取，而极性较大的物质(如酚类)较难被溶解提取，因而导致提取物对DPPH自由基的清除率偏低。超声辅助加压法与超声辅助回流法所得到的提取物对DPPH自由基的清除率均有明显的提高，主要是超声波产生的机械能对石榴籽细胞有破壁作用，使其中的有效物质在加压与回流作用下更易分离析出，从而增加有效物质的提取率，最终提高了提取物的抗氧化活性[14]。

2.2　羟基自由基清除能力

不同提取方法下的石榴籽提取物对羟基自由基的清除率见图 2。

图2　羟基自由基清除能力的比较 Fig.2　Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity

在Fenton反应体系中，羟基自由基主要由H2O2与Fe2+反应产生，加入水杨酸捕捉剂后，反应产生吸光性的有色产物。若在此体系中加入能清除羟基自由基的抗氧化剂，则能与水杨酸产生竞争而降低有色产物的生成，以此来判断其抗氧化能力的大小。由图2可知，各方法的石榴籽提取物对羟基自由基均有一定的清除作用，但在所考察浓度范围内均未超过40%，说明石榴籽提取物对羟基自由基的清除能力较弱。相对而言，超声辅助加压法与超声辅助回流法所得提取物随着浓度的升高，羟基自由基的清除能力提升较快，在浓度为1.0 mg·mL-1时羟基自由基清除率已超过其它提取方法，说明其抗氧化活性具有明显的浓度依赖性。

2.3　还原能力

不同提取方法下的石榴籽提取物的还原能力见图 3。

图3　还原能力的比较 Fig.3　Comparison of reducing power

由图3可知，各提取方法下的石榴籽提取物均具有还原能力，虽普遍偏低，但其还原能力均随浓度的增加而呈增强的趋势。尤其在实验最高浓度1.0 mg·mL-1时，超声辅助加压法以及超声辅助回流法下所得的石榴籽提取物的吸光度较其它方法显著增大，说明这两种方法下所得提取物的还原能力更大，即抗氧化活性更强。

物质的还原能力主要由供体物质提供电子能力的大小决定。各提取方法均采用无水乙醇作溶剂，容易吸收空气中的氧分子，氧化提取物中的电子供应体，因此可能导致还原能力普遍不高。而超临界法中的CO2为非极性有机溶剂，可以排除氧的干扰，保护电子供应体不被氧化，因而所得提取物的还原能力比加压法下提取物的还原能力高[14]。由图3可知，加压法提取物在低浓度范围内还原能力普遍偏低，但经过超声辅助加压提取，提取物的还原能力在较高浓度下显著提高，说明超声法与加压法耦合后对加压法提取抗氧化有效成分有明显促进作用。

2.4　脂质过氧化的抑制作用

不同提取方法下的石榴籽提取物脂质过氧化抑制率见图 4。

图4　脂质过氧化的抑制作用的比较 Fig.4　Comparison of inhibition ability of lipid peroxidation

由图4可知，各提取方法下的石榴籽提取物均对亚油酸的脂质过氧化有抑制作用。尤其超声辅助回流法和超声辅助加压法所得提取物较单一的回流法和加压法的过氧化抑制作用均有显著的提高。

据文献报道，石榴籽中多酚成分对油脂的抗氧化作用影响并不显著[11]，而其中的油脂类成分(如石榴酸)能有效地抑制油脂的过氧化变质过程。苗利利等[8]研究表明，超声法较其它提取方法所得石榴籽油提取物中的石榴酸含量较高，因此超声法所得提取物比回流、加压和超临界等方法所得提取物具有较高的脂质过氧化抑制能力。超声辅助加压法与超声辅助回流法所得提取物具有比超声法所得提取物具有更高的脂质过氧化抑制能力，这可能是在较高温度下，无水乙醇能溶解更多脂溶性成分，相比于单纯使用超声波破壁，可使以石榴酸为代表的油脂类成分的提取率明显升高，因而提取物的脂质过氧化抑制能力提高。

3结论

以无水乙醇为溶剂，比较不同提取方法(超声法、回流法、加压法、超声辅助回流法、超声辅助加压法、超临界法)对石榴籽提取物的抗氧化能力的影响。结果表明，超声法作为一种辅助方法与回流法、加压法耦合后，较单一方法下所得提取物的抗氧化能力均有显著提高，尤其对DPPH自由基的清除率分别高达92.1%和80.2%。超声辅助加压法与超声辅助回流法相比较，超声辅助加压法过程耗时短，引入杂质少，提取物抗氧化能力亦与超声辅助回流法相差不大，可以作为一种有效的提取石榴籽抗氧化活性成分的新型方法。

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Effect of Ultrasonic-Assisted Extraction Method on Antioxidant Capacity

of Pomegranate Seed Extracts

YAN Hong-mei，ZHAO Wen-ying，ZHANG Ping-ping

(CollegeofChemicalEngineering，QingdaoUniversityofScienceandTechnology，Qingdao266042，China)

Abstract：The effect of extraction methods on antioxidant capacity of extracts from pomegranate seed was studied.With anhydrous ethanol as solvent，ultrasonic method，reflux method，pressure method，ultrasonic-assisted reflux method，ultrasonic-assisted pressure method and supercritical method were used to extract antioxidant activity components from pomegranate seeds.The DPPH free radical scavenging activity，hydroxyl free radical scavenging activity，reducing power and lipid peroxidation inhibition ability of extracts were tested.The results showed that,the pomegranate seed extracts extracted by ultrasonic-assisted reflux method and ultrasonic-assisted pressure method had better antioxidant capacity compared to other methods，especially the DPPH free radical scavenging rate of pomegranate seed extracts was 92.1% and 80.2%,respectively.Therefore，the ultrasound-assisted method could significantly improve the antioxidant capacity of pomegranate seed extracts.

Keywords：pomegranate seed extract；antioxidant capacity；extraction method；ultrasonic-assisted