荧光碳点纳米材料对大肠杆菌的毒性研究

荧光碳点纳米材料对大肠杆菌的毒性研究

刘文娟,靳竞男,马家恒,姚俊

(北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083)

摘要：以革兰氏阴性菌大肠杆菌为实验模型，采用微量热法研究了碳点对细菌生长的生物效应。低浓度的碳点(0.00～5.00 mg·L-1)使得细菌的最大热功率(Ppeak)和总热量(Qtotal)增大。碳点对大肠杆菌的半抑制浓度(IC50)为18.53 mg·L-1。碳点对大肠杆菌生长的影响与其浓度有关。

关键词：碳点；大肠杆菌；微量热法；毒性效应

基金项目：国家自然科学基金杰出青年科学基金资助项目(41273092)

收稿日期：2015-05-16

作者简介：刘文娟(1986-)，女，山西忻州人，博士研究生，研究方向：纳米毒理研究，E-mail:liuwenjuan19860521@aliyun.com；通讯作者：姚俊，教授,E-mail:yaojun@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.007

中图分类号：R 378.21文献标识码：A

纳米材料作为一种具有市场应用潜力的材料，在医药、化工、电子和航空等领域得到了广泛的应用[1-3]。纳米材料在开发和应用过程中将不可避免地进入环境，对环境和人类健康产生潜在的重大危害[4]。因此，纳米材料对环境和人类的副作用需要进行深入的研究。碳点是一种零维的碳纳米材料，具有很多半导体量子点的优点，如很好的光稳定性、多色、双光子吸收截面大等[5-6]。此外，碳点还有许多半导体量子点所没有的优点，如优越的水溶性、无光闪烁性、制造成本低等。碳点不含重金属，既不污染环境又具有优良的生物相容性。由于碳点优良的物理和化学性质，它在生物学领域已经引起很多研究者的关注。碳点的表面能被各种化学基团修饰，使得它在一些新的应用领域有很大的发展潜力[7-8]。

到目前为止，碳纳米材料(如单壁碳纳米管[9]、富勒烯[10]及功能性碳纳米材料[11])对微生物或微生物群落的影响已有报道。但是，碳点纳米材料对微生物的影响未见报道。Tao等[12]研究了不同饲养时期碳点在小鼠体内的分布和毒理学，但所得的结论不一定适用于其它生物。因此，碳点对单细胞生物(细菌和真菌)的毒性研究十分必要。微生物在整个生态系统中发挥着很重要的作用，其中细菌所占的比例高达90%。大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli)由于细胞结构和功能组织与绝大多数的微生物都很类似，在环境中广泛存在，且对环境变化非常敏感，是一种广泛使用的研究分子和细胞生物学的模式生物。此外，大肠杆菌还被广泛应用于研究外源性物质(如重金属、除草剂及纳米材料等)的毒性[13-15]。

作者采用微量热法研究了碳点对大肠杆菌生长的影响。从大肠杆菌的微量热曲线计算得出大肠杆菌的生长速率常数(k)、最大热功率(Ppeak)和碳点对大肠杆菌的半抑制浓度(IC50)。

1实验

1.1　试剂与仪器

多壁碳纳米管(MWCNTs，内径20 nm,外径40 nm)，深圳纳米港有限公司。硝酸(含量65%)，硫酸(含量98%)及其它试剂，天津试剂公司。所有试剂均为分析纯，不需要任何前处理。实验中的溶液用二次蒸馏水配制。

LB培养基：氯化钠10 g·L-1,蛋白胨10 g·L-1,酵母膏5 g·L-1，120 ℃高压釜中灭菌30 min，常温下储存，备用。

TAMⅢ型多通道微量量热仪(瑞典)；日立F-4500型荧光光谱仪(日本)；岛津UV-1800型紫外可见分光光度计(日本)。

1.2　碳点纳米材料的制备

根据文献[12]方法制备碳点纳米材料。

将100 mg多壁碳纳米管置于三口烧瓶中，加入含有5 mL 65%的硝酸和15 mL 98%的硫酸的混酸。采用超声清洗机振荡混合物30 min。将混合物在80 ℃下冷凝回流24 h。冷却后将混合物移入100 mL去离子水中稀释。将稀释后的混合物经0．1 μm滤膜抽滤，并将滤液装入14 000 Da的透析袋中,用去离子水透析以除去残留的混酸,最终得到棕黄色透明液体。该液体在365 nm紫外灯照射下可发出明亮的黄色荧光。

1.3　微量热测定

采用多通道微量量热仪测定大肠杆菌的代谢产热。大肠杆菌的代谢反应在4.0 mL 不锈钢的安瓿瓶中进行。安瓿瓶使用前在电热恒温鼓风干燥箱中110 ℃下灭菌30 min。

大肠杆菌的微量热曲线的测量采用安瓿瓶法。 将2 mL 的LB培养基放入安瓿瓶内，然后分别加入不同浓度的无菌碳点，使得培养基中碳点的终浓度(mg·L-1)分别为5.00、10.0、20.0、50.0、100、200,每个安瓿瓶中都加入100 μL的大肠杆菌(OD600=0.5)。轻微涡旋，将碳点和大肠杆菌混合均匀。大肠杆菌的代谢反应在28 ℃进行，大肠杆菌的热功率-时间曲线被记录到与量热仪连接的计算机上。

2结果与讨论

2.1　碳点的光谱测定

碳点的紫外吸收光谱和荧光发射光谱如图1所示。

图1　碳点的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b) Fig.1　UV Absorption spectrum(a) and photoluminescence spectrum(b) of Cdots

由图1a可知，碳点的紫外吸收光谱与文献[16]报道一致。在紫外区域，碳点有很强的吸收峰。扫描波长越短，吸收强度越大，为典型的碳点的吸收光谱。由图1b可知，碳点的荧光光谱在496 nm 处有一个明显对称的发射峰。

2.2　大肠杆菌的微量热曲线

微量热法是一种有效且准确的研究微生物能量代谢的方法[16]。这种方法被证实可以原位长时间连续监测微生物生长代谢，并且不干扰微生物的生长过程。28 ℃时大肠杆菌的微量热曲线和OD600-时间曲线如图2所示。

图2　大肠杆菌的微量热曲线和 OD 600-时间曲线 Fig.2　Microcalorimetric curve and OD 600-time curve for E. coli

由图2可知，大肠杆菌的微量热曲线显示出特有的生长期:适应期(1)、指数期(2)、稳定期(3)、衰退期(4)。微量热曲线的峰值和OD600-时间曲线的峰值几乎同时发生。微量热曲线的每一个阶段都和细胞密度相吻合。

含有不同浓度碳点的大肠杆菌的微量热曲线如图3所示。

图3　含有不同浓度碳点的大肠杆菌的微量热曲线 Fig.3　Microcalorimetric curves of E. coli in the presence of Cdots at different concentrations

由图3可知，含有不同浓度碳点的大肠杆菌的微量热曲线形状相似，能够明显看出大肠杆菌的4个生长期。但是随着碳点浓度的增大，大肠杆菌的微量热曲线的峰值逐渐降低，说明它的整个代谢过程变缓且有延迟。

生长速率常数k是微生物活动的一个重要的定量指标，是指示微生物的化学应力和微生物呼吸的参数[17]。通过对微量热曲线中对数期部分的lnPt和t的数据进行线性拟合计算得到：

lnPt= lnP0+kt

式中：t是对数期的某一时刻；P0是微生物所有细胞进入对数期时的初始总放热功率；Pt是t时刻的总放热功率。

在大肠杆菌悬浮液中加入不同浓度碳点，大肠杆菌的代谢会受到影响，生长速率常数k发生变化。通过分析微量热曲线，得到与微生物活性相关的热力学参数，见表1。

表1含有不同浓度碳点的大肠杆菌的热力学参数

Tab.1Thermodynamic parameters ofE.coliin the presence of Cdots at different concentrations

c/(mg·L-1)k/h-1R2Ppeak/μWtpeak/hQtotal/JI/%IC50/(mg·L-1)02.900.987215.5611.496.19052.490.998232.0613.357.66914.13102.280.996198.7413.767.68321.38201.260.990168.9013.536.18756.5518.53500.310.994136.2115.135.93189.311000.220.99891.0816.755.44092.412000.160.98654.4416.944.55594.48

注：Ppeak为最大热功率；tpeak为最大热功率对应的时刻；Qtotal为总热量；I为抑制率。

2.3　生长速率常数 k与碳点浓度的关系

大肠杆菌的生长速率常数k和碳点浓度的关系如图4所示。

图4　生长速率常数 k与碳点浓度的关系 Fig.4　The relationship between growth rate constant k and concentration of Cdots

由图4可知，在低碳点浓度(0.00～5.00 mg·L-1)下，大肠杆菌没有明显的损害，生长速率常数也没有发生大的改变。这可能是大肠杆菌适应性的反应。大多数情况下，这种现象被称为应激反应，而不是真正的促进细菌生长。为了减少背景损伤，大肠杆菌可以通过增强它的生物膜进行修复和补偿[18]。但是随着碳点浓度的增大，大肠杆菌的生长速率常数明显下降。说明大肠杆菌的代谢活动被抑制或是部分大肠杆菌被杀死，存活的大肠杆菌保持较低的生长代谢。这归因于大肠杆菌的薄膜应力及它与碳点之间的氧化压力。随着碳点浓度的增大，与大肠杆菌最大热功率相对应的时刻tpeak也增大，这也证实了大肠杆菌代谢的延迟。大肠杆菌与碳点浓度的关系可以通过等式k=2.907e-0.042c+0.1146(R2=0.98)反映出来。

2.4　微量热参数 P peak、 Q total与碳点浓度的关系

大肠杆菌生长代谢的最大热功率(Ppeak) 和总热量(Qtotal)能够代表大肠杆菌在特定条件下的生长能力。Qtotal通过对微量热曲线从开始到结束进行积分计算得到。在本研究中，大肠杆菌本身的代谢Qtotal为6.190 J，这是它在安瓿瓶内代谢葡萄糖产生的热量[19]。Ppeak是大肠杆菌生长曲线的峰值。Ppeak和代谢生长的Qtotal与碳点浓度的关系如图5所示。

由图5可知，低碳点浓度(0.00～5.00 mg·L-1)下，Ppeak和Qtotal的值随着碳点浓度的增大而增大。说明低浓度的碳点对大肠杆菌的生长有促进作用。高浓度的碳点与Ppeak和Qtotal成负相关，说明碳点对大肠杆菌产生了毒性效应。这与其它荧光纳米材料对微生物生长代谢的影响类似，即低浓度的荧光纳米材料对微生物生长有刺激效应，高浓度的荧光纳米材料对微生物生长有抑制效应。

2.5　微量热参数 I和 IC 50

抑制率I可以显示加入外源物质后对微生物活性的影响，可以通过下式计算：

式中:k0为微生物本身的生长速率常数;kc为外源物质浓度为c时的生长速率常数。I值越大，说明这种物质对微生物的抑制程度越大。微量热参数I与碳点浓度的关系(I-c)如图6所示。

图5　微量热参数 P peak 和 Q total与碳点浓度的关系 Fig.5　The relationships between microcalorimetric parameters P peak (a), Q total(b) and concentration of Cdots

图6　微量热参数 I与碳点浓度的关系 Fig.6　The relationship between the microcalorimetric parameter I and concentration of Cdots

I-c可以直接显示微生物的活性与碳点浓度的关系。当抑制率为50%时的浓度定义为半抑制浓度(IC50)。IC50可以定量地表示一个物质对微生物代谢的抑制能力。IC50的值越小，说明外源物质的毒性越强。抑制率I和碳点浓度c的关系为I=-100.26e-0.042c+96.045,R2=0.98。从该式计算出IC50为18.53 mg·L-1。与量子点CdTe 对大肠杆菌的毒性相比，碳点对大肠杆菌的毒性较小。这可能是因为碳点不含重金属，而且具有良好的生物相容性。

3结论

采用微量热法研究了碳点对大肠杆菌生长代谢的影响。从微量热参数k、Ppeak和Qtotal与碳点浓度的关系推断出碳点在一定程度上抑制了大肠杆菌的生长。碳点对大肠杆菌的半抑制浓度(IC50)为18.53 mg·L-1。可见，与其它荧光纳米材料相比，碳点的毒性和抗菌性较小。因此，碳点作为低毒的荧光纳米探针在生物医学领域有很大应用潜力。

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Toxic Effect of Photoluminescent Carbon Dots Nanomaterial onEscherichiaColi

LIU Wen-juan,JIN Jing-nan,MA Jia-heng,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering，UniversityofScience&

TechnologyBeijing,Beijing100083，China)

Abstract：In this study,Gram-negative bacteria Escherichia coli(E.coli) was applied as testing model to study the biological effect of carbon dots(Cdots) on the cell growth by microcalorimetry.The introducing of Cdots caused a gradual increase of maximum heat power(Ppeak) and total heat produced(Qtotal) at low concentrations(0.00～5.00 mg·L-1).Half inhibitory concentration(IC50) of Cdots was 18.53 mg·L-1.Cdots had a concentration-dependent effect on the growth of E.coli.

Keywords：carbon dots；Escherichia coli;microcalorimetry;toxic effect