双氢青蒿素对小鼠肝纤维化形成的影响 ※

双氢青蒿素对小鼠肝纤维化形成的影响※

李校天郭永泽△

(河北工程大学附属医院消化内科，河北邯郸056002)

【摘要】目的探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)对小鼠肝纤维化形成的影响。方法将24只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为3组，即对照组、模型组及治疗组，每组各8只。模型组及治疗组小鼠予2 μL/g体质量四氧化碳(CCl4)橄榄油溶液腹腔注射，每3 d 1次，共注射12次，制备肝纤维化模型。对照组小鼠予等量、等次橄榄油溶剂腹腔注射。治疗组于腹腔注射CCl4橄榄油溶液8次后，予20 μg/g体质量DHA原药灌胃给药，同时对照组及模型组小鼠予等容积含二甲基亚砜(DMSO)0.9%氯化钠注射液灌胃。均每日1次，直至处死前 1 d。最后一次注射后48 h，所有小鼠处死取肝组织，肉眼观察，并进行苏木精—伊红(HE)染色和天狼星红染色，然后光学显微镜观察。结果模型组及治疗组肝组织病理证实肝纤维化模型建立成功，治疗组小鼠肝小叶破坏、肝细胞变性及纤维组织增生程度均低于模型组，天狼星红染色面积较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论DHA能够改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化程度。

【关键词】青蒿素；肝硬化；四氯化碳；疾病模型，动物；小鼠；实验

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.00.000

【中图分类号】R285.5；R284.2；R657.31；R285.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)03-0400-03

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of dihydroartemisinin (DHA) on hepatic fibrosis mice.Methods24 male C57BL/6 wile-type mice were randomly divided into control group, model group and treatment group, 8 mice in each group. Liver Fibrosis model in model group and treatment group were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (CCl4) diluted with olive oil once every third day for 12 times. Mice in control group received intraperitoneal injection of olive oil at a same dose and same times as other groups. After 8 times of injection, mice in treatment group received 20 μg/g of DHA via gastrogavage, mice in other two groups received isasteric dimethyl sulfoxide diluted with sodium chloride injection by gastrogavage. Mice in all groups were sacrificed 48 hours after the final injection of CCl4. The changes of liver tissue were observed by hematoxylin, eosin and sirius red staining. ResultsModel foundation of liver fibrosis in model group and treatment group were confirmed by histological analysis. The degree of liver lobular damage, liver cell degeneration and fibrous tissue hyperplasia in treatment group were lower than those in model group. The percentage of sirius red staining area in treatment group was less than that in model group(P<0.05). ConclusionDHA can improve degree of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice.

通讯作者：△河北工程大学附属医院消化内科，河北 邯郸 056002

作者简介：李校天(1964—)，男，教授，硕士。研究方向：慢性肝病、肝纤维化的诊疗。

收稿日期：(2014-12-12)

Effects of dihydroartemisinin on hepatic fibrosis miceLIXiaotian,GUOYongze.DepartmentofGastroenterology,TheHospitalAffiliatedtoHeibeiEngineeringUniversity,Hebei，Handan056002

【Key words】Dihydroartemisinin; Liver fibrosis; Carbon tetrachloride; Mice; Disease model; Animal; Experiment

※ 项目来源：2013年邯郸市科学技术研究与发展计划(第二批)(编号：1323108088-5)

肝纤维化是各种慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段。因此，逆转或阻止肝纤维化是目前研究的热点。但是至今尚未找到理想的抗肝纤维化药物。双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的衍生物，具有免疫调节、抗肿瘤及抗疟疾等作用[1]。近年来有研究表明，青蒿琥酯可能有通过抑制肝星状细胞增殖而发挥抗肝纤维化作用[2]。本研究应用DHA干预实验性肝纤维化小鼠，探讨其对肝纤维化形成的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性C57BL/6野生型小鼠24只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。所有小鼠均自由采食饮水，清洁级饲料喂养。实验过程符合中华人民共和国《实验动物管理条例》及伦理要求。

1.1.2药物及试剂DHA(标准品)，购自上海纯优生物科技有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成母液，4 ℃保存，实验前用0.9%氯化钠注射液配制DMSO终浓度<0.1%。四氯化碳(CCl4)，Sigma-Aldrich公司，临用前用橄榄油(Sigma-Aldrich)以25%容积分数配成油剂溶液。小鼠抗α-SMA单抗隆抗体购自DAKO 公司。

1.1.3主要仪器YBL-2生物组织包埋机，湖北孝感亚光医用电子技术研究所；HM-315组织切片机，德国Walldorf公司；Olympus BX51光学显微镜，日本Olympus公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组将24只小鼠随机分为3组，即对照组、模型组及治疗组，每组各8只。

1.2.2模型制备模型组及治疗组小鼠予2 μL/g体质量CCl4橄榄油溶液腹腔注射，每3 d 1次，共注射12次，制备肝纤维化模型。对照组小鼠予等量、等次橄榄油溶剂腹腔注射。

1.2.3治疗方法及剂量治疗组于腹腔注射CCl4橄榄油溶液8次后，予20 μg/g体质量DHA原药灌胃给药，同时对照组及模型组小鼠予等容积含DMSO 0.9%氯化钠注射液灌胃。每日1次，直至处死前 1 d。

1.2.4标本采集及制备最后一次注射后48 h，所有小鼠麻醉处死，打开腹腔，无菌下取肝组织，肉眼观察其颜色、质地等，用冰磷酸盐缓存液(PBS)洗去血迹，取相同部位右肝组织，10%多聚甲醛固定24 h，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。肝组织5 μm连续切片，常规苏木精—伊红(HE)染色和天狼星红染色[3]。然后光学显微镜下观察肝组织结构改变和胶原沉积情况，并采用image-Pro Plus软件对肝组织胶原沉积进行定量分析。

2结果

2.1肉眼观察3组小鼠肝脏组织肉眼观察对照组小鼠肝脏颜色呈红褐色，表面光滑，质地柔软。模型组小鼠肝脏颜色发黯，表面颗粒样粗糙，质地较韧。治疗组上述改变均较模型组减轻。

2.23组小鼠肝脏组织显微镜下观察HE染色：对照组小鼠肝小叶结构显示完整，肝板排列规整，肝细胞形态完好，仅门管区见少量结缔组织(见封3，图1)。模型组肝小叶结构完整性破坏，肝细胞脂肪变性明显，炎细胞浸润，结缔组织增生，假小叶形成(见封3，图2)。治疗组小鼠肝小叶破坏、肝细胞变性及结缔组织增生的程度均低于模型组(见封3，图3)。天狼星红染色：对照组仅汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维(见封3，图4)。模型组汇管区周围出现大量胶原纤维，相邻肝小叶之间纤维间隔增厚(见封3，图5)。治疗组上述改变均较模型组减轻(见封3，图6)。

2.33组小鼠天狼星红染色阳性面积比较采用image-Pro Plus软件分析，结果显示，模型组天狼星红染色阳性面积高于对照组(P<0.05)，治疗组天狼星红染色阳性面积明显低于模型组(P<0.05)。见图7。

图7　3组天狼星红染色阳性面积比较

3讨论

肝纤维化的特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内异常沉积，是一种进展性的创伤—修复病理过程[4-5]。肝纤维化的形成和演变是一个动态变化的过程，当ECM的合成超过降解时，肝纤维化形成并加重。但如果在肝纤维化形成的任何环节加以干预，即在合适的靶点对肝纤维化进行治疗，使ECM的降解多于合成，肝纤维化则会发生逆转。目前为止，肝纤维化还没有理想的治疗方法，因此寻找合适

的治疗药物为目前研究的焦点。

DHA是我国研发的一个倍半萜内酯类化合物，具有独立知识产权，是青蒿素的一个重要衍生物，其分子式为C15H24O5，分子量为28.35。近年来研究发现，DHA除了具有抗疟作用外，其在体内外亦具有较强的抗炎、抗肿瘤等作用[6-7]。吴苹等[8]研究发现，DHA可以调节肾炎小鼠炎症因子的释放，减轻肾脏炎症程度。袁晓梅等[9]应用DHA治疗大鼠肺纤维化模型发现，DHA呈剂量依赖性抑制大鼠肺纤维化。然而，其对肝纤维化的作用如何，少有报道。

我们采用CCl4腹腔注射方法制备小鼠肝纤维化模型，应用DHA灌胃干预治疗，利用HE染色及天狼星红染色评价其对肝纤维化的影响。研究结果显示，肝纤维化模型制备成功，DHA能够延缓肝纤维化，与陈冰燕等[10]研究结果一致。关于其干预纤维化的机制，我们正在通过其对胶原纤维合成的影响、对炎性反应及对肝星状细胞等方面的影响进行深入研究。

参考文献

[1]Wang CM,Li HX,Zhang XF.Role of Fas, FasL and Caspase-3 in artesunate-induced apoptosis of human embryonic lung fibroblasts[J].J Clin Rehabil Tissue Eng Res，2011，15(20)：3785-3788.

[2]张晓燕，马淑晶，徐亚洁，等.青蒿琥酯对人源肝星状细胞LX-2增殖、胶原产生以及KLF6表达的影响[J].天津医科大学学报,2014,20(4)：258-259，263.

[3]王伯沄，李玉松，黄高异，等．病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2001：144.

[4]Hernandez-Gea V，Friedman SL. Pathogenesis of liver fibrosis[J].Annu Rev Pathol，2011，(6)：425-456.

[5]Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury[J]. J Biol Chem，2000，275(4)：2247-2250.

[6]周立文，贝文政，王建才.双氢青蒿素对恶性疟疾的疗效及免疫调节作用观察[J].热带病与寄生虫学，2008，6(3)：138-139.

[7]Chen H，Sun B，Pan S，et al.Dihydroartemisinin inhibits growth of pancreatic cancer cells in vitro[J]．Anticancer Drugs，2009，20(2)：132-140.

[8]吴苹，李启杰，夏增亮，等.小鼠肾炎模型的制备及双氢青蒿素对其炎症因子释放的影响[J].华西医学，2011，26(7)：1028-1031.

[9]袁晓梅，袁彬，马五林.双氢青蒿素对大鼠肺组织纤维化的干预作用[J].中华实用儿科临床杂志，2013，28(16)：1253-1256.

[10]陈冰燕，李超乾，覃先连.双氢青蒿素对百草枯致小鼠肺纤维化的治疗研究[J].广西医科大学学报，2012，29(2)：175-178.

(本文编辑：李立)

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